目的:1.探討負(fù)性共刺激分子LAG3與PD-1在乳腺癌患者T細(xì)胞中共表達(dá)的特點(diǎn)。2.分析LAG3與PD-1共表達(dá)時(shí)對(duì)T細(xì)胞功能的影響。3.探討LAG3與PD-1不同阻斷治療策略對(duì)乳腺癌發(fā)展的影響。方法:1.根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn),臨床入組乳腺癌患者,收集其外周血及腫瘤組織,流式細(xì)胞技術(shù)分析患者外周血、腫瘤浸潤性、癌旁組織中T細(xì)胞LAG3與PD-1共表達(dá)的特點(diǎn),并根據(jù)臨床分期和分子分型進(jìn)行分層分析其二者的共表達(dá)特點(diǎn);2.通過CFSE染色、BrdU摻入及ELISA法分別檢測LAG3與PD-1不同表達(dá)對(duì)T細(xì)胞增值與分泌功能的影響;3.免疫組化法分析乳腺癌組織、癌旁組織中LAG3與PD-1的主要配體MHCⅡ類分子、FGL1和PD-L1的表達(dá)情況,并比較它們?cè)诓煌R床分期與分子分型乳腺癌中的差異性;4.通過EMT6和E0771小鼠乳腺癌建模,分別進(jìn)行LAG3、PD-1的單一或聯(lián)合單克隆抗體阻斷治療,觀察小鼠腫瘤的生長情況,從而反向驗(yàn)證LAG3與PD-1共表達(dá)對(duì)乳腺癌發(fā)展的影響。結(jié)果:1.經(jīng)過知情同意、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后,共入組乳腺癌患者112例,其中收集外周血標(biāo)本82例,癌組織及癌旁組織標(biāo)本47例... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

參與T細(xì)胞耗竭相關(guān)抑制性分子及其受體[31]

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文22可見離心管中液體至下而上分成五層：最下層是紅細(xì)胞層，第二次層是微白膜層的粒細(xì)胞，第三層是分離液，第四層是白膜層，也就是我們需要的富含外周血單核細(xì)胞（PBMC）的細(xì)胞層，最上層為血漿層，富含血小板；如圖1所示；圖2.密度梯度離心后的分層情況Figure2.Layeredsolutionsituationafterthedensitygradientcentrifugation(5)將最上面的血漿層輕柔吸棄，再用吸管沿管壁周輕輕吸取第二層的單個(gè)核細(xì)胞，并移入另一支15ml的試管中；(6)加入5倍以上體積的Hank’s液，充分混勻，1800r/min離心10min，吸棄上清液；(7)重復(fù)使用3ml的Hank’s液洗滌一次，1400r/min離心10min，吸棄上清液；(8)再次加入1-2ml的Hank’s液重懸，用移液管吸取20μl進(jìn)行濃度定量，從計(jì)數(shù)板邊緣緩慢滴入；(9)在顯微鏡下用10x物鏡觀察計(jì)數(shù)板四個(gè)大方格中的細(xì)胞數(shù)（壓線細(xì)胞我們采取記上不記下，計(jì)左不計(jì)右策略）：細(xì)胞數(shù)/L=（4大格細(xì)胞數(shù)之和/4）x107；(10)對(duì)獲取的PBMC加入4%PBS-B漂洗、離心重懸，行計(jì)數(shù)濃度調(diào)整至106個(gè)/ml，為下一步進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)的表型分析備用。1.2.4外周血T淋巴細(xì)胞LAG3與PD-1表型鑒定在獲取乳腺癌患者和對(duì)照組的PBMC后，通過流式抗體標(biāo)記后行LAG3與

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文28≥50[n,(%)]37(45.1)20(42.5)8(44.4)腫瘤最大直徑(cm)＜2[n,(%)]48(58.5)26(55.3)N/A0.723**≥2[n,(%)]34(41.5)21(44.7)N/A臨床分期Ⅰ期[n,(%)]23(28.0)15(31.9)N/A0.538**Ⅱ期[n,(%)]42(51.2)21(44.7)N/AⅢ期[n,(%)]13(15.9)11(23.4)N/AⅣ期[n,(%)]4(4.9)N/A***N/A分子分型ER+或PR+[n,(%)]39(47.6)21(44.7)N/AHER2+[n,(%)]21(25.6)12(25.5)N/A0.929**TN[n,(%)]22(26.8)14(29.8)N/A注：數(shù)量：n（例）；y:year（歲）；N/A：NotApplicable（不適用）；*：t-檢驗(yàn)；**：卡方檢驗(yàn)；***：IV期病人未行手術(shù)切除，也就未獲得其組織標(biāo)本。2.2不同臨床分期與分子分型乳腺癌患者PBL中LAG3+PD-1+T細(xì)胞比例沒有顯著差異性圖3.流式細(xì)胞技術(shù)分析外周血中LAG3與PD-1雙陽性表達(dá)T細(xì)胞的百分比Figure3.FlowcytometryanalysisofthepercentageofLAG3andPD-1doublepositiveTcellsinperipheralblood.Representativeflowcytometryimages.我們通過流式細(xì)胞技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者和健康自愿者的外周血T細(xì)胞中LAG3與PD-1雙陽性T細(xì)胞（Tcells,TC）的比例均非常低，無論在不同臨床

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]PD-L1/PD-1在三陰性乳腺癌中的研究進(jìn)展[J]. 張蝶,高雅茹,劉麗,袁夏,賈婷婷,王之穎,曾海榮,王旭慧,王瑋,袁易.  腫瘤學(xué)雜志. 2019(11)
[2]PD-1和PD-L1在腫瘤免疫逃逸中的作用機(jī)制及臨床意義[J]. 烏日罕,呼群,馬強(qiáng),趙甡慧.  現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué). 2019(09)
[3]PD-1、CTLA-4和MMP9在伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者外泌體中的表達(dá)[J]. 王愛紅,趙菊梅,王明全.  現(xiàn)代免疫學(xué). 2019(02)
[4]SHP2 inhibition triggers anti-tumor immunity and synergizes with PD-1 blockade[J]. Mingxia Zhao,Wenjie Guo,Yuanyuan Wu,Chenxi Yang,Liang Zhong,Guoliang Deng,Yuyu Zhu,Wen Liu,Yanhong Gu,Yin Lu,Lingdong Kong,Xiangbao Meng,Qiang Xu,Yang Sun.  Acta Pharmaceutica Sinica B. 2019(02)
[5]非小細(xì)胞肺癌組織中PD-1/PD-L1的表達(dá)及臨床意義[J]. 吳菡,吳健,石永利,劉文杰.  臨床腫瘤學(xué)雜志. 2019(03)
[6]PD-1/PD-L1在治療三陰性乳腺癌中的研究進(jìn)展[J]. 林炳靜,徐寒梅,孫晴波,胡加亮.  藥物生物技術(shù). 2019(01)
[7]免疫治療相關(guān)蛋白PD-1/PD-L1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 陶海云,屈中玉,吳艷林,蔡政.  癌癥進(jìn)展. 2019(02)
[8]乳腺癌中p53、PD-1和PD-L1的表達(dá)及相關(guān)性分析[J]. 程敏,史玉潔,孔令非.  臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志. 2018(12)
[9]PD-1/PD-L1在非特殊型浸潤性乳腺癌中的表達(dá)及意義[J]. 李瑩瑩,董麗儒,李宇陽,熊艷杰,宋旭東.  廣東醫(yī)學(xué). 2018(11)
[10]PD-1/PD-L1在三陰性乳腺癌中的研究進(jìn)展[J]. 宋林霞,呂水萍,馬虎.  醫(yī)學(xué)研究雜志. 2018(06)



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