發(fā)布時間：2021-08-19 07:31

　　蛋白質(zhì)翻譯后修飾是對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的精細調(diào)節(jié),是細胞生命活動中關鍵的調(diào)控機制。越來越多的證據(jù)表明翻譯后修飾之間存在交互調(diào)控,并且這種交互調(diào)控可以精巧地調(diào)控復雜的細胞信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡。磷酸化修飾是生命活動中最普遍也是研究最廣泛的翻譯后修飾,但是目前磷酸化修飾和�；揎椊换フ{(diào)控的全局性認識仍然匱乏。本文利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學技術(shù)通量大、靈敏度高、定量準確性高的優(yōu)勢,對磷酸化修飾和�；揎椧约傲姿峄揎椇头核鼗揎椫g的交互調(diào)控進行了深入的探討。首先對AMPK（Adenosine 5‘-monophosphate-activated protein kinase）介導的磷酸化在DNA損傷反應中的分子機制,以及其與組蛋白乙�；揎椫g的交互調(diào)控在其中的功能進行了探究。AMPK介導的磷酸化被廣泛認為是能量代謝調(diào)控的核心,但是其在腫瘤細胞中的角色仍不明確。有研究顯示AMPK可以通過調(diào)控DNA損傷反應參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程,而DNA損傷修復需要組蛋白修飾介導的染色質(zhì)調(diào)節(jié)。基于此,我們首先利用TALENs（Transcription activator-like effector nucleases）技... 

【文章來源】：中國科學院大學(中國科學院上海藥物研究所)上海市

【文章頁數(shù)】：141 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

基于MOAC磷酸化肽段富集原理[57]

基于蛋白質(zhì)組學技術(shù)的磷酸化修飾和�；揎椊换フ{(diào)控的機制與功能研究8磷酸化肽段的富集。在SCX中，強酸性的磷酸化肽段和陰離子固定相結(jié)合較弱，可以從色譜柱中流出；在SAX中，強酸性的磷酸化肽段和陽離子固定相結(jié)合較強，保留在色譜柱的固定相上。因此，在這兩種IEC的方法中，都可以實現(xiàn)磷酸化肽段和非磷酸化肽段的分離，從而達到富集的效果。但是由于肽段自身的電荷狀態(tài)非常復雜，酸性的側(cè)鏈殘基和賴氨酸（K）、精氨酸（R）電荷中和后，會進一步降低IEC對于磷酸化肽段的區(qū)分能力。此外IEC自身的分離能力也較差，所以一般IEC主要和IMAC或MOAC結(jié)合，提供多一個維度的分離，降低單個組分中樣品的復雜程度，從而提高磷酸化肽段的鑒定深度。這種結(jié)合IEC和IMAC或MOAC的組合型策略是目前磷酸化蛋白質(zhì)組學中應用最廣泛的磷酸化肽段富集策略（圖1.5）。圖1.5SCX/IMAC磷酸化肽段富集組合型策略[61]Figure1.5SCX/IMACcombinationstrategyforphosphopeptideenrichment細胞經(jīng)裂解后得到的蛋白混合物經(jīng)過還原反應打開二硫鍵，并通過烷基化試劑封閉半胱氨酸的巰基側(cè)鏈，然后通過胰酶酶切產(chǎn)生肽段，肽段混合物先通過SCX進行組分分離，再分別對每一個組分進行磷酸化肽段的富集，最后將洗脫下來的磷酸化肽段進行質(zhì)譜分析。（5）親水相互作用色譜富集法近些年來，親水相互作用色譜（HydrophilicInteractionChromatography，HILIC）逐漸被視為SCX和SAX的替代方法。HILIC的流動相是水相緩沖液和有機溶劑，固定相是強吸水性的極性吸附。和反相色譜法（Reverse-phaseChromatography，RPC）相反，HILIC使用的洗脫梯度是從高有機相（如95%的乙腈）逐步降低到水相。分析物在HILIC中，根據(jù)親水性的不同被分離，極性越強分析物保留時間

基于蛋白質(zhì)組學技術(shù)的磷酸化修飾和酰化修飾交互調(diào)控的機制與功能研究18圖1.11組蛋白翻譯后修飾的結(jié)構(gòu)[117]Figure1.11Structuresofhistonepost-translationalmodifications組蛋白上的不同的修飾類型以及修飾位點的組合通常稱為組蛋白密碼（histonecode），由組蛋白修飾酶（writer）、去修飾酶（eraser）調(diào)節(jié)。組蛋白上的各種翻譯后修飾又可以被各類基因調(diào)控相關效應蛋白識別（reader），形成“閱讀器-修飾”的識別配對，進一步調(diào)控基因的表達[113]。組蛋白翻譯后修飾的異常調(diào)控和許多疾病密切相關[118]。1.2.3.2基于生物質(zhì)譜的組蛋白修飾組學的研究方法在早期，組蛋白的翻譯后修飾還無法通過先進的生物質(zhì)譜檢測。組蛋白翻譯后修飾一般通過同位素標記和化學方法鑒定。例如，組蛋白乙�；尿炞C過程：將乙酸鈉-14C2與細胞或分離的核一起溫育后，14C同位素迅速摻入組蛋白，表明14C同位素是由賴氨酸側(cè)鏈上的乙�；揎椈騈端乙�；鸬�。并且嘌呤霉素不能抑制同位素的摻入表明該過程是在蛋白質(zhì)合成后發(fā)生的[119]。進一步的通過進行組蛋白的氨基酸分析表明，乙酸鹽-14C2可以摻入到乙酰賴氨酸上[120]。隨著技術(shù)的發(fā)展，可以通過質(zhì)譜根據(jù)候選修飾引起的假定質(zhì)量變化來檢測修飾�；蛘�，可以開發(fā)針對目的組蛋白標記的序列獨立性和序列特異性抗體，并通過蛋白質(zhì)印跡分析和免疫染色將其用于探測組蛋白標記。芝加哥大學的YingmingZhao教授實驗室發(fā)展了一套基于生物質(zhì)譜的無偏向性查找新型組蛋白


本文編號：3350994