目的:胰島素作為體內(nèi)最主要降低血糖的激素,對(duì)機(jī)體葡萄糖的代謝至關(guān)重要。胰島素的生物合成過(guò)程起始于在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上翻譯為胰島素的前體-前胰島素原。前胰島素原轉(zhuǎn)位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后,形成胰島素的另一個(gè)前體-胰島素原。胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊后,輸出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入高爾基體。在高爾基體中被酶解為胰島素和C肽。成熟的胰島素和C肽儲(chǔ)存在分泌顆粒中,在葡萄糖刺激下,分泌到細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用。胰島素作為分泌蛋白,其分泌通路的順暢對(duì)形成足夠量有活性的胰島素是基本保證。胰島素原轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的前提條件是胰島素原必須折疊形成其天然結(jié)構(gòu),然后被COP-Ⅱ囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體中。研究證實(shí),胰島素基因突變誘導(dǎo)的青少年糖尿病造成血糖升高是由于胰島素原在折疊過(guò)程中三個(gè)二硫鍵不能正確形成,導(dǎo)致胰島素原不能形成可以輸出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的天然狀態(tài)。有研究報(bào)道,野生型胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊過(guò)程中也會(huì)形成10%-20%錯(cuò)誤折疊的胰島素原,但當(dāng)減少野生型胰島素原輸出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后,野生型胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的狀態(tài)變化還不是很清楚,因此本研究擬探討減少胰島素原轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng),對(duì)胰島素合成量及胰島素原狀態(tài)的影響及對(duì)β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。方法:本研究通過(guò)兩種... 

【文章來(lái)源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：102 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

胰島素量降低，胰島素原分泌量減少.A免疫印跡分析細(xì)胞內(nèi)胰島素原和胰島素量及分泌到培養(yǎng)基中胰島素原和胰島素的量

免疫熒光染色顯示胰島素原在核周聚集的現(xiàn)象（圖2.2），但在過(guò)表達(dá) sar-1A 突變體（H79G，T39N）組，胰島素原核周聚集現(xiàn)象消失，呈現(xiàn)彌散在細(xì)胞質(zhì)中，即使有核周聚集表型，蛋白聚集量也明顯減少（圖 2.2）。在正常細(xì)胞中，高爾基體的免疫熒光表型為核周聚集而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表現(xiàn)為彌散在細(xì)胞質(zhì)中。所以在過(guò)表達(dá) sar-1A 突變后，胰島素原被阻滯在了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其轉(zhuǎn)運(yùn)效率明顯降低。圖 1 Sar-1A 蛋白突變影響 COP-Ⅱ囊泡的組裝。A，sec31 蛋白的免疫熒光。MIN6 細(xì)胞感染相應(yīng)腺病毒 24 小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，滲透，封閉，孵育 1抗和 2 抗

27圖 3.1 胰島素原轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)效率降低導(dǎo)致胰島素原錯(cuò)誤折疊。A 免疫印跡分析 MIN6 細(xì)胞中胰島素原折疊情況。MIN6 細(xì)胞感染相應(yīng)病毒 24 小時(shí)后，裂解細(xì)胞提取蛋白。加入相應(yīng)量的非還原上樣緩沖液，100℃煮 5 分鐘。之后將樣品等體積分成 2 份，一份加入樣本體積的十分之一的 1M 二硫蘇糖醇，另一份不加任何試劑。100℃煮 5 分鐘。之后進(jìn)行還原和非還原免疫印跡實(shí)驗(yàn)。B 定量分析胰島素原低聚體和高分子量胰島素原與胰島素原單體的比例。分別用胰島素原低聚體和高分子量胰島素原的灰度值除以胰島素原單體的灰度值,統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：t 檢驗(yàn)，*p≤0.05。C 免疫印跡分析 MIN6 細(xì)胞中胰島素原折疊情況。MIN細(xì)胞處理 5um BFA5 小時(shí)后裂解細(xì)胞提取蛋白。加入相應(yīng)量的非還原上樣緩沖液，100℃煮 5 分鐘。之后將樣品等體積分成 2 份，一份加入樣本體積的十分之一的 1M 二硫蘇糖醇，另一份不加任何試劑。100℃煮 5 分鐘。最后進(jìn)行還原和非還原免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相應(yīng)蛋白表達(dá)情況。D 定量分析胰島素原低聚體和高分子量胰島素原與胰島素原單體的比例。分別用胰島素原低聚體和高分子


本文編號(hào)：3348068