本文關(guān)鍵詞：弓形蟲表面抗原蛋白5的結(jié)構(gòu)分析及免疫學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：弓形蟲是一種機會性胞內(nèi)寄生蟲,它能夠感染幾乎所有的溫血動物包括野生哺乳動物、鳥類、家畜和人類。由弓形蟲感染而引起的弓形蟲病遍布全球各個角落,弓形蟲病是人獸共患病,嚴重威脅畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康。目前尚無針對弓形蟲病的特效藥物,因此對弓形蟲病的防治工作迫在眉睫。本實驗利用相應(yīng)軟件和在線數(shù)據(jù)庫分析了弓形蟲表面抗原蛋白5 (Surface Antigen Glycoprotein 5, SAG5)的理化特點、同源性、二維結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)、B細胞抗原表位和T細胞抗原表位。構(gòu)建SAG5A和SAG5D的DNA重組疫苗來免疫小鼠,并利用抗原多肽和α半乳糖神經(jīng)酰胺(a-GalCer)增強疫苗的免疫反應(yīng),通過動物實驗驗證疫苗的可靠性。本研究工作填補了弓形蟲表面抗原蛋白SAG5的認知空白,為弓形蟲病有效疫苗的研制提供了參考。目的：研究弓形蟲表面抗原蛋白SAG5的基本理化性質(zhì)、二維結(jié)構(gòu)和三維空間結(jié)構(gòu)。分析弓形蟲表面抗原蛋白SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的B細胞抗原表位和T細胞抗原表位。構(gòu)建SAG5A基因的重組DNA載體并與多肽(HAPTPSFLGLLAVVF)一同免疫小鼠,通過對小鼠腦部包囊計數(shù)來評價SAG5A基因與多肽的免疫保護性。構(gòu)建SAG5D基因表達載體并與a-GalCer-同免疫小鼠,通過弓形蟲速殖子和包囊攻擊實驗來評價SAG5D基因和a-GalCer一起對小鼠的免疫保護性。方法：利用在線分析軟件預(yù)測SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的理化性質(zhì)、跨膜區(qū)域和信號肽序列。運用在線程序PSORTⅡ分析SAG5A、 SAG5B、SAG5C和SAG5D的亞細胞定位。利用在線程序NetNGlyc1.0分析SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的N-糖基化位點。運用在線程序CSS-Palm和NetPhos 2.0分析SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的磷酸化位點和酰基化位點。利用DNASTAR、Gene Runner和DNAMAN等軟件預(yù)測SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的B細胞抗原表位。利用在線分析軟件IEDB預(yù)測SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的T細胞抗原表位。利用在線工具T-Coffee對這四種蛋白的序列進行比對,運用在線分析軟件SWISS-MODEL和軟件VMD預(yù)測SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的二維和三維結(jié)構(gòu)。利用引物設(shè)計軟件設(shè)計出SAG5A和SAG5D的上下游引物,PCR反應(yīng)得到SAG5A和SAG5D的目的基因,經(jīng)過雙酶切將目的基因和pEGFP-C1載體連接在一起構(gòu)建SAG5A和SAG5D的真核表達載體。構(gòu)建好的載體通過測序來檢驗SAG5A和SAG5D基因的完整性。利用試劑盒大量提取構(gòu)建的SAG5A和SAG5D真核表達質(zhì)粒來免疫BALB/c小鼠。在SAG5D基因疫苗免疫小鼠過程中通過加入佐劑α半乳糖神經(jīng)酰胺(a-GalCer)來提高免疫效應(yīng)。構(gòu)建的SAG5A基因疫苗引入抗原多肽并通過免疫策略來提高免疫效果。在基因疫苗免疫后對小鼠取血并收集血清,通過檢測小鼠血清中抗弓形蟲總IgG、IgG1、 IgG2a及脾細胞內(nèi)細胞因子IL-4、IL-10、IFN-y的含量來評價疫苗刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。對SAG5D和a-GalCer免疫的小鼠通過弓形蟲速殖子(RH株)和包囊(PRU株)攻擊實驗來驗證疫苗的保護性。對SAG5A和抗原多肽免疫的動物用包囊(PRU株)攻擊來驗證免疫策略的作用及基因疫苗的保護性。結(jié)果：利用軟件和在線工具分析了SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D四種蛋白的理化性質(zhì),結(jié)果顯示SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D擁有相似的物理化學(xué)參數(shù),其中SAG5A和SAG5D有相近的理化參數(shù),SAG5B和SAG5C有著更為相近的理化性質(zhì)。運用在線程序PSORTⅡ分析這四種蛋白的亞細胞定位,結(jié)果顯示SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D均分布在質(zhì)膜上的概率最大。對這些蛋白翻譯后修飾的預(yù)測發(fā)現(xiàn)它們有相似的糖基化位點、磷酸化位點和�；稽c,其中SAG5B和SAG5C的修飾位點基本一致。利用DNASTAR軟件和IEDB數(shù)據(jù)庫分析了SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D蛋白的B細胞抗原表位,結(jié)果顯示SAG5B和SAG5C具有相近的B細胞抗原表位,利用在線IEDB數(shù)據(jù)庫分析它們的T細胞抗原表位,并篩選出一些優(yōu)秀的親水性強、可塑性大和抗原指數(shù)高的抗原表位區(qū)域,結(jié)果表明這四種蛋白均是良好的表位抗原,此外我們還用這些軟件和數(shù)據(jù)庫分析了SAG1蛋白的B細胞和T細胞表位抗原,并將這四種蛋白的表位抗原與SAG1比較,結(jié)果顯示SAG5A和SAG5D有更優(yōu)秀的抗原表位,SAG5B和SAG5C的抗原表位與SAG1相近。經(jīng)過T-Coffee軟件的序列比對,SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D具有很高的同源性,而SAG5B和SAG5C的相似度更是達到了96%。通過DNASTAR和VMD軟件分析,SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D蛋白具有相近的β折疊和α螺旋區(qū)域,而SAG5B和SAG5C有著幾乎一樣的β折疊和α螺旋分布。經(jīng)過VMD軟件分析,這些蛋白有著相似的三維空間結(jié)構(gòu),而SAG5B和SAG5C的空間結(jié)構(gòu)幾乎完全一樣。利用引物設(shè)計軟件成功設(shè)計出SAG5A和SAG5D的上下游引物,以弓形蟲cDNA為模板,利用PCR反應(yīng)得到產(chǎn)物,經(jīng)過凝膠電泳分析得到大小均為1,089 bp的SAG5A和SAG5D基因片段,利用膠回收試劑盒回收并純化大量目的基因SAG5A和SAG5D。將目的基因和pEGFP-C1真核表達載體雙酶切,在DNA連接酶的幫助下,將目的基因和載體連接在一起。重組后載體轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細胞,菌液涂板后每個培養(yǎng)皿中得到5-10個獨立菌株,將菌株挑到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),利用質(zhì)粒提取試劑盒將菌體中質(zhì)粒提取出來,雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳實驗顯示在4,700bp和1,089bp處有明亮條帶,這證明我們成功構(gòu)建了pEGFP-C1-SAG5A (pSAG5A)和pEGFP-C1-SAG5D (pSAG5D)的真核表達載體。將菌體大量培養(yǎng),利用無內(nèi)毒素大提試劑盒大量提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒,檢測提取質(zhì)粒的濃度均在1,000 μg/ml以上,達到后續(xù)試驗要求。為驗證構(gòu)建載體在細胞內(nèi)正常表達,將無內(nèi)毒素載體轉(zhuǎn)染至HEK 293-T細胞,利用熒光顯微鏡觀察pSAG5A和pSAG5D轉(zhuǎn)染的細胞,兩組細胞均能被激發(fā)出綠色熒光,這說明重組載體可在細胞中正常表達蛋白。將轉(zhuǎn)染的細胞大量收集并裂解提取細胞全蛋白,并對提取的蛋白進行Western blot實驗檢測,結(jié)果在60 kD處有特異性條帶出現(xiàn),進一步證明了重組載體中SAG5A和SAG5D基因能夠成功表達成蛋白。pSAG5A載體和篩選的多肽依據(jù)制定的策略先后免疫BALB/c小鼠,pSAG5D真核表達載體和a-GalCer一同免疫小鼠,每次免疫2周后對對照組(PBS和pEGFP-C1組)和免疫組(a-GalCer、pSAG5、pSAG5、pSAG5D/a-GalCer和pSAG5A/多肽組)小鼠進行取血,吸取血清并檢測其中抗弓形蟲總IgG、IgG1、IgG2a抗體的濃度。pSAG5A和多肽免疫的小鼠血清中IgG和IgG2a抗體的水平顯著高于對照組和其它實驗組(P0.05); pSAG5A免疫組和多肽免疫組中IgG和IgG2a抗體的水平明顯高于空白對照組(P0.05),pSAG5A免疫組和多肽免疫組之間沒有顯著性差別(P0.05)；實驗組和對照組小鼠的IgG1抗體濃度沒有顯著性差異(P0.05)。pSAG5D和α-GalCer-同免疫的小鼠血清中IgG和IgG2a抗體的水平明顯高于其它組(P0.05)；pSAG5D免疫組和α-GalCer免疫組中IgG和IgG2a抗體的水平顯著高于空白對照組(P0.05),而pSAG5D免疫組和α-GalCer免疫組之間沒有顯著性差別(P0.05)；各組小鼠的IgG1抗體濃度沒有顯著性差異(P0.05)。為進一步證明小鼠的免疫反應(yīng),小鼠脾細胞中細胞因子IL-、IL-10、IFN-γ的水平被檢測。pSAG5A和多肽共同免疫組中IFN-γ的水平(721.0±99.6)顯著高于其它實驗組和對照組(P0.05)；pSAG5A(505.3±71.6)和多肽(489.7+98.9)兩個實驗組中的IFN-y水平顯著高于空載體組(52.4+11.6)和PBS組(55.5±11.7)(P0.05),但兩者之間沒有顯著性差異(P0.05)；而細胞因子IL-4和IL-10的水平在各組間沒有顯著性差別(P0.05)。pSAG5D和α-GalCer一起免疫小鼠脾細胞的IFN-y水平(781.36±57.57)顯著高于其它組(P0.05);pSAG5D組(573.43±60.2)和α-GalCer組(343.6±50.88)中的IFN-γ水平明顯高于pEGFP-C1組(53.15±8.71)和PBS組(52.07+8.23)(P0.05); pSAG5D和α-GalCer共同免疫組(76.73±6.08)及α-GalCer免疫組(75.46±5.7)中小鼠脾細胞中IL-4的水平顯著高于pSAG5D組(36.65±3.52)、pEGFP-C1組(39.24±6.43)和PBS組(36.36±5.25)(P0.05)；而所有小鼠的IL-10的水平?jīng)]有顯著性差異(P0.05)。最后通過弓形蟲攻擊實驗來評價基因疫苗的免疫保護性。用弱毒株(PRU)弓形蟲包囊攻擊SAG5A所有組的小鼠,結(jié)果顯示pSAG5A和多肽共同免疫小鼠腦內(nèi)的包囊數(shù)量(436±174)明顯少于其它組(P0.05)；pSAG5A組(815±197)和多肽組(732±160)小鼠腦內(nèi)包囊顯著性少于pEGFP-C1組(1350±268)和PBS組(1260±241)(P0.05),而pSAG5A組和多肽組之間沒有顯著性差別。另一實驗中,用強毒株(RH)弓形蟲速殖子和弱毒株(PRU)包囊攻擊SAG5D所有組的小鼠,結(jié)果顯示pSAG5D和α-GalCer一起免疫小鼠的生存期能達到17天,而pSAG5D組、α-Ga1Cer、 pEGFP-C1和PBS組的生存時間分別為13天、10天、7天和6天。同時pSAG5D和α-GalCer免疫小鼠腦內(nèi)包囊數(shù)量最少(P0.05)。結(jié)論：生物信息學(xué)分析表明SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的同源性很高,這四種蛋白都具有優(yōu)秀的B細胞抗原表位和T細胞抗原表位,且SAG5A和SAG5D蛋白的抗原性更加突出。真核表達載體pSAG5A和pSAG5D均能在真核細胞中和小鼠體內(nèi)成功表達；SAG5A和SAG5D基因疫苗均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強烈的體液免疫和細胞免疫；a-GalCer確實能夠增強弓形蟲SAG5D基因疫苗的免疫效應(yīng)；抗原多肽與SAG5A基因疫苗的策略使用能夠誘導(dǎo)更強烈的免疫效應(yīng)；在動物實驗中這兩種DNA疫苗均能為小鼠提供抵抗弓形蟲感染的免疫能力。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 表面抗原蛋白5 生物信息學(xué) 體液免疫 細胞免疫
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R382.5
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 符號說明17-19
• 前言19-23
• 第一部分 弓形蟲表面抗原蛋白5(SAG5)生物信息學(xué)分析23-37
• 一 材料23
• 二 方法23-24
• 三 結(jié)果24-35
• 四 討論35-37
• 第二部分 弓形蟲表面抗原蛋白5A(SAG5A)的免疫學(xué)研究37-73
• 一 材料37-43
• 二 方法43-59
• 三 結(jié)果59-69
• 四 討論69-73
• 第三部分 弓形蟲表面抗原蛋白5D(SAG5D)的免疫學(xué)研究73-94
• 一 材料73
• 二 方法73-80
• 三 結(jié)果80-91
• 四 討論91-94
• 附圖94-96
• 參考文獻96-106
• 致謝106-107
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論著107-108
• 發(fā)表論文1108-122
• 發(fā)表論義2122-137
• 附件137

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 魏嬋娟;閆冰;馬振儒;陳文杰;梁官釗;陳曉寧;;承德市郊小學(xué)生藍氏賈第鞭毛蟲感染情況調(diào)查分析[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2011年02期

2 徐勝;張玲;陳春福;邱國院;申麗潔;;大理市市售腌菜中寄生蟲卵的檢測分析[J];大理學(xué)院學(xué)報;2010年02期

3 申金雁;殷國榮;李佩珍;;旅客列車直排糞便污染的危害及控制對策[J];國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志;2006年02期

4 劉瑩;錢程;陳相任;曾德權(quán);何愛娟;楊遠花;盧作超;劉登宇;;180例就診者人芽囊原蟲的感染情況調(diào)查[J];應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2008年05期

5 李雪蓮,史兆興,武峰;超氧化物歧化酶在現(xiàn)代寄生蟲學(xué)中的研究進展[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2005年02期

6 方彥炎;楊發(fā)柱;陳朱云;李燕榕;;1例嬰兒西里伯瑞列絳蟲病[J];海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2012年02期

7 殷國榮;楊亞波;李佩珍;;中國常見的食物源性寄生蟲病及其防治對策[J];疾病控制雜志;2006年04期

8 李明杰;程家求;鄧長林;;黑猩猩司氏伯特絳蟲感染的診治[J];金陵科技學(xué)院學(xué)報;2011年01期

9 孫博;李云章;楊曉野;古革軍;烏日山;;馴鹿鹿皮蠅蛆病流行病學(xué)調(diào)查[J];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2010年04期

10 方彥炎;李莉莎;張榕燕;鄭國斌;江典偉;;廣州管圓線蟲實驗室模型建立的研究[J];海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2012年04期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張先福;川楝素對孕鼠的胚胎毒性與子宮局部免疫毒理學(xué)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

2 趙廣會;弓形蟲蛋白酶的鑒定及免疫學(xué)研究[D];山東大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 琚瑞利;福州地區(qū)硬蜱分布情況調(diào)查及微小牛蜱生物學(xué)特性研究[D];福建師范大學(xué);2011年

2 元海軍;TSo和IFN-γ鼻內(nèi)免疫小鼠誘導(dǎo)的抗弓形蟲保護性免疫應(yīng)答[D];山西醫(yī)科大學(xué);2004年

3 沈[?瓊;致敏IEL過繼轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)的小鼠腸道粘膜免疫應(yīng)答及抗弓形蟲感染作用[D];山西醫(yī)科大學(xué);2004年

4 斯健;兩種宿主來源毛首線蟲形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的分類研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2005年

5 李雪蓮;超氧化物歧化酶在釀酒酵母中的分泌表達[D];鄭州大學(xué);2005年

6 趙洪喜;馴鹿狂蠅生物學(xué)特性及對機體抗氧化能力影響的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

7 張利;蒙古羊與多塞特羊體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)與消化道線蟲感染關(guān)系的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

8 岳峰;馴鹿狂蠅蛆病對機體NO和NOS的影響及藥物防治的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

9 弓鴻飛;STAg聯(lián)合IFN-γ佐劑滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的弓形蟲特異性黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答[D];山西醫(yī)科大學(xué);2006年

10 呂華林;復(fù)方伊維菌素、芬苯噠唑粉劑的研制及療效試驗[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

  本文關(guān)鍵詞：弓形蟲表面抗原蛋白5的結(jié)構(gòu)分析及免疫學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：332679