本文關鍵詞：結核分枝桿菌臨床分離株乙胺丁醇耐藥分析及其耐藥相關基因的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:結核分枝桿菌對乙胺丁醇產(chǎn)生耐藥的臨床特點以及耐藥相關分子機制比較復雜,需要進一步研究,尤其是與耐藥相關的基因突變也有待進一步發(fā)現(xiàn)。為此,本研究通過分析乙胺丁醇耐藥的特點和產(chǎn)生的危險因素、耐藥相關基因的突變方式以及突變可能引起的蛋白質(zhì)功能變化、非編碼區(qū)突變造成的二級結構改變等幾個方面來更加全面的闡述結核分枝桿菌對乙胺丁醇產(chǎn)生耐藥的機制。方法:1.臨床回顧性分析研究選取了2129株臨床結核分枝桿菌及其相應的結核病病例。人口學資料和菌株耐藥性分析分為乙胺丁醇耐藥組和敏感組,并分別比較兩組的差異。乙胺丁醇耐藥危險因素主要分析了不規(guī)則用藥、藥物副反應、原發(fā)耐藥;與異煙肼和利福平耐藥進行比較,重點比較了用藥次數(shù)、用藥時間和治療方案這三個方面的不規(guī)則用藥。2.耐藥相關基因突變研究:選擇了Rv0179c,Rv0026,Rv1058,Rv1699,Rv2807,Rv2947c,Rv3756c,Rv3877,Rv1080c-Rv1081c,Rv1482c-Rv1483,Rv2416c-Rv2417c,Rv3796-Rv3797,Rv2427c-Rv2428,Rv2733-Rv2734,Rv2754c-Rv2755c,Rv3428c-Rv3429,Rv3793-Rv3794,Rv3901c-Rv3902c,Rv3806,emb B,emb A,emb C和emb R,共23個基因。研究選取了183株EMB耐藥菌株。提取183株EMB耐藥結核分枝桿菌的DNA,分別用PCR方法擴增獲取相應片段,并對這些片段分別測序兩次,測序結果與H37Rv(ATCC 27294)比對,找到相關的突變位點,并查找氨基酸的變化形式。運用Predict SNP軟件預測氨基酸的突變對蛋白質(zhì)結構和功能的影響。通過H37Rv(ATCC 27294)密碼子偏好庫查找了同義突變密碼子的偏好性變化。運用Gene Quest分析堿基突變前后非編碼RNA結構的變化。結果:1.2129株臨床菌株中,有228株對乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)耐藥,耐藥比例為10.71%;其中1130株是全敏感菌株,比例為53.08%。在228株EMB耐藥菌株中,初治病例為181例(79.4%),復治為47例(20.6%);異煙肼(isoniazid,INH)耐藥164株(71.9%),利福平(Rifampicin,RFP)耐藥171株(75%),耐多藥結核病(multi-drug resistant tuberculosis,MDR-TB)134株(58.8%)。比較EMB耐藥組和EMB敏感組發(fā)現(xiàn)兩者僅在初復治的比例方面存在顯著差異(P=0.01),EMB耐藥組中復治結核病人的比例高;而在病人年齡、性別、吸煙歷史以及結核病合并其他疾病方面差異都不顯著(P0.05)。在EMB耐藥菌的耐藥譜方面:EMB耐藥組平均對2種以上的抗結核藥物耐藥(2.19±0.10),EMB敏感組平均對0.79±0.04種藥耐藥,兩組差異顯著(P0.001)。EMB耐藥組中的MDR-TB所占的比例(58.8%)高于EMB敏感組(17.0%),二者差異極顯著(P0.001),這提示高比例的MDR-TB是EMB耐藥組耐藥譜廣的主要原因。在EMB耐藥性產(chǎn)生的危險因素方面:EMB耐藥的主要危險因素是不規(guī)則治療(47.25%),藥物副反應(4.40%)和原發(fā)性耐藥(48.35%)。從不規(guī)則治療的次數(shù)來看,在耐藥性產(chǎn)生之前EMB被使用過2.86±0.69次,較INH(1.67±0.88次)和RFP(1.39±0.61次)高,說明EMB反復使用較多次數(shù)之后才產(chǎn)生耐藥性。從不規(guī)則藥物治療時間(少于6個月)來看,EMB產(chǎn)生耐藥所需時間為5.0±0.94月,較INH(3.78±1.28月)和RFP(3.89±0.60月)時間長。而不規(guī)則藥物治療(6個月以上)中,EMB、INH和RFP三者產(chǎn)生耐藥性所需的時間沒有差異。2.在所有研究的基因中,Rv0026,Rv1058,Rv1699,Rv2807,Rv3756,Rv2416c-6Rv2417c,Rv3796-Rv3797,Rv2733-Rv2734,Rv2754c-Rv2755c和Rv3428c-Rv3429的堿基突變率分別為2.5%、1.25%、1.25%、2.5%、0、0、0、0、2.5%和1.25%,突變率很低,而且沒有任何重復性。Rv0179c,Rv2947c和Rv3877突變較多。Rv0179c共有18個位點發(fā)生了堿基突變,分別是S102*、A198G、S214L、L215P、D236E、F254L、V62A、G164A、S166I、W167C、S169T、T170T、N182T、H183R、Q186R、K202E、G204A和Y227F,共有46株菌突變,占所分析160株EMB耐藥菌株的28.75%。Rv2947c有D213G和P448S突變,共8株菌突變,占167株EMB耐藥菌的4.79%。Rv3877有11個位點發(fā)生了堿基突變,分別是P39S、E45D、G370G、I439I、L454L、L88L、C203*、Q281H、I289T、A354A和S466S,總共突變16株菌,占所分析168株EMB耐藥菌株的9.52%。基因芯片的生物信息學分析表明:在EMB刺激下,上述突變頻率較高的三個基因的表達水平都顯著增高;而那些突變頻率很低的基因的表達水平則不受EMB刺激的影響。emb R、emb A、emb C、emb B、Rv3806基因的突變率分別是3.3%、3.8%、4.1%、74.17%、8.46%,其中emb R、emb A、emb C、Rv3806的突變菌株大多同時存在emb B基因突變。emb B基因有6個位點的突變,分別是emb B306、emb B328、emb B354、emb B406、emb B439、emb B497、emb B531,突變率分別為54.6%、1.8%、3.7%、31.7%、8.3%、5%。emb B306有6種堿基突變形式,3種氨基酸突變形式,分別是M306VM306IM306L,突變率為54.6%。emb B406有31.7%突變率,而且emb B406傾向于不與emb B306同時發(fā)生突變。通過預測以下氨基酸突變對蛋白質(zhì)的結構和功能會有不良影響:emb R基因的P243S,emb A基因的L105V、R380P突變,emb B基因的M306L、D328H、G406D、Q497K、Q497R;Rv0179c基因的S166I、W167C、K202E、L215P、D236E、F254L突變;Rv2947c的D213G突變;Rv3877基因的P39S和I289T的突變。其余突變形式對蛋白質(zhì)的結構和功能的影響為中性。有5個非編碼區(qū)發(fā)生了較多且有重復性的突變,它們分別是Rv1080 cRv1081c(Rv1080c-Rv1081c)、Rv1482c-Rv1483、IG1872(Rv2427c-2428)、IG2934(Rv3793-Rv3794)和IG3021(Rv3901c-Rv3902c)。這些位點的突變會引起非編碼RNA二級結構的改變。結論:1.EMB耐藥在結核病臨床中較為常見,其中原發(fā)性EMB耐藥較多,其發(fā)生與病人年齡、性別、吸煙歷史以及結核病合并其他疾病無顯著關系。2.EMB耐藥菌具有較廣的耐藥譜,其中MDR-TB菌占多數(shù)。3.臨床中EMB和INH、RFP相比不容易產(chǎn)生耐藥,表現(xiàn)在它在產(chǎn)生耐藥前持續(xù)用藥時間長且多次反復使用。4.研究的23個基因中,emb基因是EMB耐藥中突變率最高的基因,其中又以emb B306密碼子和emb B406密碼子的突變率最高,且emb B406傾向于不與emb B306密碼子同時發(fā)生突變(P=0.037)。5.實驗篩選到Rv0179c、Rv2947c和Rv3877三個新基因在EMB耐藥菌中存在較高的突變率。6.實驗篩選到Rv1080c-Rv1081c、Rv1482c-Rv1483、IG1872(Rv2427c-Rv2428)、IG2934(Rv3793-Rv3794)、IG2991(Rv3862c-Rv3863)、IG3021(Rv3901c-Rv3902c),共5個非編碼區(qū)在EMB耐藥菌中存在較高的突變率,突變會造成非編碼RNA二級結構的改變。7.突變有非同義突變(氨基酸突變)和同義突變。部分氨基酸突變較大地影響了蛋白結構和功能;同義突變使密碼子的偏好性降低,從而對蛋白的合成造成影響,進而影響了耐藥表型。
【關鍵詞】：結核分枝桿菌 乙胺丁醇 耐藥 治療 危險因素 突變 基因 分子機制
【學位授予單位】：北京市結核病胸部腫瘤研究所
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446.5;R52
【目錄】：

• 英文縮略詞9-12
• 摘要12-16
• Abstract16-21
• 前言21-24
• 參考文獻22-24
• 第一章 EMB耐藥結核病的臨床回顧性分析24-43
• 材料和方法24-29
• 1.材料24-26
• 1.1 研究對象24
• 1.2 試驗試劑和儀器24-26
• 1.2.1 試驗儀器24
• 1.2.2 主要試劑及配制24-26
• 2.方法26-29
• 2.1 臨床分析26-27
• 2.1.1 EMB耐藥人.學特點26
• 2.1.2 EMB耐藥菌株耐藥譜26-27
• 2.1.3 EMB耐藥危險因素的分析27
• 2.2 藥敏試驗的絕對濃度法27-29
• 2.2.1 藥物濃度27-28
• 2.2.2 結核分枝桿菌復蘇28
• 2.2.3 結核分枝桿菌的培養(yǎng)28
• 2.2.4 菌液接種28-29
• 2.2.5 判定標準29
• 3．統(tǒng)計方法29
• 結果29-36
• 1.菌株的一般耐藥特點29-30
• 2.EMB耐藥病人的人.學特點30
• 3. EMB耐藥的藥物譜30-33
• 4. 常見耐藥風險因素在EMB上的體現(xiàn)33-34
• 5. 不規(guī)則治療在INH、RFP和EMB藥物上的具體體現(xiàn)34-36
• 5.1 耐藥性產(chǎn)生前的用藥次數(shù)比較34
• 5.2 耐藥性產(chǎn)生前的治療時間比較34-36
• 討論36-39
• 1．EMB耐藥結核病的耐藥率36-37
• 2．常見耐藥性危險因素在EMB藥物上的體現(xiàn)37-38
• 3．EMB耐藥性與耐藥譜的關系38
• 4．EMB耐藥與INH/RFP耐藥的聯(lián)系38-39
• 結論39-40
• 參考文獻40-43
• 第二章 EMB耐藥相關基因突變研究43-91
• 材料和方法43-56
• 1. 試驗材料43-47
• 1.1 研究對象43-45
• 1.1.1 EMB耐藥結核分枝桿菌43-44
• 1.1.2 待研究基因44-45
• 1.2 試驗試劑和儀器45-47
• 1.2.1 試驗試劑45-46
• 1.2.2 試驗儀器46-47
• 2. 試驗方法47-56
• 2.1 DNA提取47-48
• 2.2 目的片段擴增48-49
• 2.2.1 引物合成48
• 2.2.2 PCR48-49
• 2.2.3 電泳49
• 2.3 DNA測序49-52
• 2.4 基因突變分析52-54
• 2.4.1 突變位點分析52-53
• 2.4.2 SNP非同義突變危害程度53
• 2.4.3 同義突變密碼子偏好性53-54
• 2.5 分析方法54-56
• 結果56-76
• 1. 各基因擴增片段結果56-57
• 2. 突變很少的基因57-58
• 3. embB、embA、embC、embR、Rv3806c58-64
• 3.1 embB58-59
• 3.2 embA59
• 3.3 embC59-60
• 3.4 embR60
• 3.5 Rv3806c60-62
• 3.6 不同突變對蛋白功能和表達的影響62-64
• 4. 突變頻率較大的新基因64-67
• 4.1 Rv0179c65
• 4.2 Rv2947c65
• 4.3 Rv387765-67
• 5.同義突變67
• 6. EMB刺激下的芯片數(shù)據(jù)再分析67-68
• 7．多種位點、基因突變聯(lián)合檢測耐藥68-69
• 8. 非編碼區(qū)69-76
• 8.1 非編碼區(qū)的堿基突變69-74
• 8.2 非編碼區(qū)堿基突變引起的非編碼RNA結構改變74-76
• 討論76-84
• 1. EMB耐藥的機制76-79
• 1.1 編碼基因的突變形式和頻率76-78
• 1.2 EMB耐藥性突變在耐藥性檢測中的應用78-79
• 2.三個突變頻率較高的基因的功能79-80
• 2.1 Rv0179c79
• 2.2 Rv2947c79
• 2.3 Rv387779-80
• 3.耐藥相關基因突變：非同義突變和同義突變各自的生物學意義80-82
• 4.非編碼RNA功能82-84
• 結論84-85
• 參考文獻85-91
• 附表 191-101
• 論文綜述101-127
• 一、結核分枝桿菌的耐藥機制101-110
• 1.結核分枝桿菌細胞壁的物理屏障作用101-102
• 2.細胞膜上藥物外排泵的藥物泵出菌體作用102-103
• 3.結核分枝桿菌耐藥基因突變103-110
• 3.1 利福平104-105
• 3.2 異煙肼105-107
• 3.3 氟喹諾酮107-108
• 3.4 吡嗪酰胺( PZA) 耐藥的分子機制108-110
• 二、EMB的耐藥機制110-116
• 1．EMB的作用機理110-111
• 2.EMB分子耐藥機制111-116
• 2.1 與EMB有關的藥物外排泵111-112
• 2.2 與EMB有關的耐藥基因突變112-116
• 參考文獻116-127
• 攻讀博士學位期間發(fā)表文章127-129
• 博士期間參與申請的基金129-130
• 致謝130-131
• 個人簡歷131

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 全國結核病流行病學抽樣調(diào)查技術指導組;2000年全國結核病流行病學抽樣調(diào)查報告[J];中國防癆雜志;2002年02期

  本文關鍵詞：結核分枝桿菌臨床分離株乙胺丁醇耐藥分析及其耐藥相關基因的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：329847