背景:膠質(zhì)瘤是惡性程度最高的腦腫瘤,手術難以全切,對放化療易產(chǎn)生耐受。自噬異常是膠質(zhì)瘤對放化療產(chǎn)生耐受的原因之一,但其調(diào)控的機制不明。研究表明,T-淋巴細胞來源的蛋白激酶（TOPK）在膠質(zhì)瘤干細胞中特異性表達,與膠質(zhì)瘤放化療耐受、復發(fā)密不可分,但作用機制尚不清楚。目的:1、明確TOPK與自噬的關系。2、闡明TOPK調(diào)節(jié)自噬的分子機制。3、探索TOPK調(diào)控自噬后在膠質(zhì)瘤對替莫唑胺（TMZ）耐藥中的作用。方法:1、收集膠質(zhì)瘤臨床標本和人源性膠質(zhì)瘤細胞株,Western Blot方法檢測自噬活性標志分子（LC3-II和P62）。2、采用沉默或過表達方法降低或增加TOPK表達或采用TOPK特異性抑制劑抑制其活性,Western Blot方法檢測自噬活性標志分子（LC3-II和P62）水平;透射電鏡實驗和熒光實驗觀察自噬體。3、采用生物信息學技術預測TOPK潛在底物:ULK1是其中之一。4、構建ULK1三個功能域的真核表達質(zhì)粒,采用Pull down方法確認TOPK與ULK1的相互作用及作用部位。5、采用NetPhos 2.0預測ULK1潛在的磷酸化位點并體外合成相對應肽段。6、體外激酶實驗和質(zhì)... 

【文章來源】：華中科技大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

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TOPK、LC3-II和P62在膠質(zhì)瘤臨床標本及人源性膠質(zhì)瘤細胞中的表達

華中科技大學博士學位論文46表達的Hs683和H4細胞中加入不同濃度梯度的TOPK抑制劑OTS964，MTT方法檢測OTS964的毒性作用，WesternBlot方法檢測LC3-II和P62。MTT結果顯示，OTS964作用48h對這兩株細胞均無毒性的最高濃度是2μM（圖1-2A）；WesternBlot結果顯示，OTS964處理48h，LC3-II的表達升高，P62的表達下降，且呈劑量依賴性（圖1-2B），表明抑制TOPK活性，促進LC3-II表達，抑制P62表達，即抑制TOPK促進自噬。圖1-2TOPK抑制劑OTS964誘導Hs683和H4細胞自噬（A）在Hs683和H4細胞中加入OTS964，MTT方法檢測OTS964對細胞的毒性。左：Hs683細胞。右：H4細胞。（B）在Hs683和H4細胞中加入OTS964，WesternBlot方法檢測LC3-II和P62。左：Hs683細胞。右：H4細胞。組蛋白H3(Ser10)的磷酸化用來反映TOPK的活性。其次采用shRNA的方法在Hs683和H4細胞中沉默TOPK建立TOPK的沉默穩(wěn)定細胞系，并選擇沉默效果最好的兩株細胞，即shTOPK#2和shTOPK#5（圖1-3A）進行后續(xù)實驗。結果顯示，與未沉默組細胞相比，TOPK沉默組細胞的LC3-II表達明顯升高，P62的表達明顯下降（圖1-3B），表明沉默TOPK表達，促進LC3-II表達，抑制P62表達，即抑制TOPK促進自噬。

華中科技大學博士學位論文47圖1-3沉默TOPK誘導Hs683和H4細胞自噬（A）在Hs683和H4細胞中沉默TOPK，WesternBlot方法檢測沉默效果。左：Hs683細胞。右：H4細胞。（B）在Hs683和H4細胞中沉默TOPK，WesternBlot方法檢測LC3-II和P62。左：Hs683細胞。右：H4細胞。最后，通過在TOPK低表達的U118MG細胞中過表達HA-TOPK，建立TOPK過表達的穩(wěn)定細胞系進一步驗證TOPK抑制自噬。結果顯示，TOPK過表達細胞中LC3-II的表達低于對照組，而P62的表達高于對照組（圖1-4），表明過表達TOPK，抑制LC3-II表達，促進P62表達，即TOPK抑制自噬。圖1-4過表達TOPK抑制U118MG細胞自噬綜合上述實驗結果，我們得出結論：在膠質(zhì)瘤細胞中，TOPK高表達抑制自噬。3.1.2在膠質(zhì)瘤細胞中TOPK抑制自噬起始為了進一步明確TOPK抑制自噬的詳細機制，作用于自噬過程的哪個階段？我們采用HBSS激活自噬和氯喹（CQ）阻斷自噬體與溶酶體的融合，采用三種實驗方法觀察自噬流。首先，在Hs683細胞中摸索CQ最適處理條件和HBSS最佳作用時間，圖1-5A顯示：CQ的最適濃度為50μM，最佳處理時間為3h，HBSS的最佳處理時間為6h。然后，用上述條件處理TOPK沉默的Hs683和H4


本文編號：3252019