發(fā)布時(shí)間：2021-06-25 19:16

　　研究背景和目的一氧化氮（NO）是一種性質(zhì)活躍的氣體信號(hào)分子,發(fā)揮血管舒張、突觸傳遞及免疫防御等多種生理功能。目前的研究還發(fā)現(xiàn)NO與腫瘤關(guān)系密切,調(diào)控腫瘤的起始、轉(zhuǎn)移、耐藥和免疫逃逸等一系列過(guò)程。內(nèi)源性的NO主要由三種一氧化氮合酶（NOS）催化生成。其中NOS1和NOS3為組成型表達(dá),合成低濃度的NO;而NOS2為誘導(dǎo)性型表達(dá),合成高濃度的NO。不同的NOS產(chǎn)生NO的濃度及持續(xù)時(shí)間不同,決定了其生物學(xué)效應(yīng)的不同。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明,不同NOS的亞細(xì)胞定位也是決定其功能的重要因素之一。目前發(fā)現(xiàn)不同的NOS亞型可以定位于細(xì)胞膜、溶酶體、高爾基體及細(xì)胞核等不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。既往已經(jīng)有研究顯示NO參與了結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等一系列過(guò)程,但NOS1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究的主要目的是探討NOS1是否通過(guò)其特殊的亞細(xì)胞定位參與結(jié)腸癌的進(jìn)展。研究結(jié)果1.NOS1定位于結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體:分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示NOS1表達(dá)量與結(jié)直腸腺癌患者的臨床分期呈負(fù)相關(guān),并且NOS1高表達(dá)提示預(yù)后較差。為了深入研究NOS1對(duì)結(jié)腸癌的影響,我們構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NOS1的結(jié)腸癌細(xì)胞株。應(yīng)用... 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：104 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１?ｍｔＮＯＳ對(duì)線粒體功能的影響??Ｆｉ．?１?Ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｍｔＮＯＳ?ｏｎ?ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ?ｆｌｉｎｃｔｉｏｎ??

篩選陽(yáng)性細(xì)胞。最后用Ｑ－ＰＣＲ和蛋白免疫印跡法分別從ｍＲＮ?Ａ和蛋白水平驗(yàn)證對(duì)??照組（ＮＣ）與過(guò)表達(dá)Ｎ０Ｓ１組（ＯＥ－ＮＯＳ１）結(jié)腸癌細(xì)胞株中Ｎ０Ｓ１的表達(dá)情況。??結(jié)果顯示０Ｅ－Ｎ０Ｓ１結(jié)腸癌細(xì)胞Ｎ０Ｓ１的ｍＲＮＡ和蛋白表達(dá)均有顯著升高（圖１－２）。??以上結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)Ｎ０Ｓ１的結(jié)腸癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。??Ａ?＞５?１＾］?丁?８?ＮＣ?０Ｅ－Ｎ０Ｓ１??§?ｓｏ－?ｎｏｓｉ?｜?—??ｇａｐｏｈ??｜Ｅ?５〇１?■?：：＾——??？?５?５－ｒ??■??■??〇ｉ?ｍ??ＮＣ?ＯＥ－ＮＯＳ１??圖１－２構(gòu)建過(guò)表達(dá)ＮＯＳＩ的結(jié)腸癌細(xì)胞株??（Ａ）?Ｑ－ＰＣＲ檢測(cè)ＮＯＳ１的ｍＲＮＡ的表達(dá)；（Ｃ）?ＷＢ檢測(cè)ＮＯＳ１蛋白的表達(dá)；??Ｆｉｇ．?１－２?Ｃｏｌｏｎ?ｃａｎｃｅｒ?ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ?ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ?ＮＯＳＩ?ｗｅｒｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ??（Ａ）?ＮＯＳＩ?ｍＲＮＡ?ｉｎ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｃｅｌｌｓ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｄｃｔｅｄ?ｂｙ?Ｑ－ＰＣＲ；?（Ｂ）?ＮＯＳＩ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ??ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｃｅｌｌｓ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｄｃｔｅｄ?ｂｙ?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ．??第３節(jié)提取細(xì)胞線粒體，觀察ＮＯＳＩ在線粒體的定位??為了驗(yàn)證ＮＯＳ１是否在定位于線粒體內(nèi)

異性標(biāo)記物Ｍｉｔｏｔｒａｋｅｒ－ＲＥＤ標(biāo)記線粒體，使線粒體帶有紅色熒光，使用綠色熒光??蛋白（ＧＦＰ）標(biāo)記Ｎ０Ｓ１蛋白。我們?cè)诠簿劢癸@微鏡下清晰地觀察到Ｎ０Ｓ１（綠色??熒光）與線粒體（紅色熒光）存在共定位關(guān)系（重疊后呈現(xiàn)黃色）（圖１－４）。此結(jié)果進(jìn)??一步表明Ｎ０Ｓ１在結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體內(nèi)表達(dá)。??■■ＭＭ?，，??Ｉ?ｓｏ．?＾?＾??１Ｗ??ＮＯＳｌ?Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ?Ｍｅｒｇｅ?＾??圖１＿４共聚焦顯微鏡觀察線粒體與Ｎ０Ｓ１的共定位關(guān)系。??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ?ａｎｄ?ＮＯＳｌ?ｗａｓ?ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ?ｂｙ?ｃｏｎｆｏｃａｌ??ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．??第５節(jié)過(guò)表達(dá)ＮＯＳｌ增加線粒體內(nèi)一氧化氮含量??ＮＯＳ１是一種鈣離子依賴性一氧化氮合酶，而線粒體內(nèi)的鈣離子濃度較高。??因此我們推測(cè)，線粒體內(nèi)ＮＯＳ?１蛋白表達(dá)的增加會(huì)提高線粒體內(nèi)一氧化氮的含量，??進(jìn)而影響線粒體生物學(xué)功能。由于一氧化氮是一種不穩(wěn)定的氣體分子，我們通??過(guò)檢測(cè)其下游代謝物亞硝酸／硝酸鹽以反映ＮＯ水平。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)Ｎ０Ｓ１??（０Ｅ－Ｎ０Ｓ１）明顯增加線粒體內(nèi)亞硝酸／硝酸鹽含量（圖１－５）。該結(jié)果進(jìn)一步證??明ＮＯＳ?１在線粒體內(nèi)表達(dá)，并增加了線粒體內(nèi)ＮＯ水平。??３０??


本文編號(hào)：3249799