發(fā)布時(shí)間：2017-04-24 00:08

  本文關(guān)鍵詞：系統(tǒng)性紅斑狼瘡血漿microRNA表達(dá)譜篩查與驗(yàn)證的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種病程反復(fù)的自身免疫性疾病,好發(fā)于育齡期的女性,主要表現(xiàn)在多個(gè)器官的受累,包括腎臟、皮膚、關(guān)節(jié)、血液和神經(jīng)系統(tǒng)等的炎癥反應(yīng),疾病的活動(dòng)情況會(huì)隨著時(shí)間出現(xiàn)波動(dòng),患者血清中會(huì)出現(xiàn)以抗核抗體為代表的多種自身抗體。我國的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),狼瘡的患病率高達(dá)70/10萬。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種多因素的復(fù)雜病,其臨床表現(xiàn)多種多樣,多呈隱匿起病,臨床癥狀因個(gè)人差異不盡相同,這表明SLE的發(fā)病機(jī)制可能涉及多個(gè)因素的相互作用。系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未明確,目前的觀點(diǎn)普遍認(rèn)為SLE的致病因素包括自然環(huán)境因素(紫外線照射和化學(xué)物質(zhì)接觸等)、生物學(xué)環(huán)境(細(xì)菌、病毒感染等)、社會(huì)環(huán)境因素(壓力、精神創(chuàng)傷等)、基因易感性及內(nèi)分泌狀況等諸多方面。這些因素之間相互作用和影響,最終導(dǎo)致SLE病人體內(nèi)的免疫功能紊亂�，F(xiàn)在針對(duì)SLE的治療仍然是一個(gè)很大的爭論,雖然可緩解病情和提高病人生活質(zhì)量的治療藥物被不斷的研發(fā)出來,但仍然沒有一個(gè)確定的特異性治療方法,還有大量病人的癥狀仍然無法得到徹底或有效的控制,而且長期的炎癥和與藥物有關(guān)的副作用可能會(huì)造成永久性的器官損傷,這與該病預(yù)后的生命質(zhì)量下降以及死亡率的上升是密切相關(guān)的。因此對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡病因及發(fā)病機(jī)制的研究就顯得尤為重要。已有研究表明,輔助性T細(xì)胞(Th)在SLE及其它自身免疫疾病的發(fā)病中起重要作用。從免疫學(xué)上講,SLE是自身免疫耐受損傷和自身抗原介導(dǎo)的T、B淋巴細(xì)胞過度活化所導(dǎo)致的。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一類含有約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA,主要通過與靶m RNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)互補(bǔ)配對(duì),從而造成m RNA降解或蛋白質(zhì)的表達(dá)受到抑制,介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。人類大約有30%編碼蛋白的基因受mi RNAs調(diào)節(jié),包括凋亡、細(xì)胞分化和分裂、脂代謝、造血和病毒防御等。有研究表明,mi R-326能夠通過抑制Ets-1轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而促進(jìn)輔助性T細(xì)胞17(Th17)的分化;并且mi R-326表達(dá)水平與自身免疫性疾病的疾病活動(dòng)度顯著相關(guān)。而本課題組已通過前期研究證實(shí),Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子參與了SLE的發(fā)病,并首次提出Th17可能作為SLE的治療靶點(diǎn)。此外,課題組參與的兩項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)證實(shí)Ets-1是SLE的易感基因。由此,我們提出了Ets-1在SLE中可能的作用通路。據(jù)此推測mi RNA可能通過調(diào)控一些關(guān)鍵的靶基因,從而在SLE的發(fā)病中起重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道多個(gè)mi RNA與自身免疫性疾病有關(guān),它們是否也參與SLE的發(fā)病尚不清楚。血漿mi RNA具有含量豐富、性質(zhì)穩(wěn)定、易于檢測等特征,已作為一類新型生物標(biāo)志物用于腫瘤等慢性非傳染性疾病的早期篩查、診斷和預(yù)后評(píng)估研究,但在SLE中多為在外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)研究,對(duì)SLE患者血漿mi RNA表達(dá)譜的報(bào)道較少。近年有研究表明micro RNA-101通過靶向調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)m RNA的3’UTR區(qū)來控制MAPK的水平,同時(shí)影響其下游細(xì)胞因子的分泌。MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)眾多與SLE發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞因子,例如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-a)、白細(xì)胞介素1(interleukin 1,IL-1)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)和干擾素(interferon,IFN)等等,它們都在SLE的發(fā)病中都扮演著至關(guān)重要的角色。有研究顯示,mi RNA是通過結(jié)合靶m RNA的3'UTR區(qū)域從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其表達(dá)的調(diào)控,無論是IL-6還是TNF-a,它們的3'UTR區(qū)域中都含有micro RNA-16的結(jié)合位點(diǎn)。此外,許多研究均顯示micro RNA-16的過表達(dá)會(huì)使IL-6、IL-8和TGF-β的表達(dá)量下降。因此,我們意圖通過ELISA檢測IL-6、IL-17和TNF-a的表達(dá)量是否與mi R-16-5p和mi R-101-3p的表達(dá)相關(guān)。基于以上,本研究擬通過mi RNA芯片檢測SLE患者和正常對(duì)照血漿mi RNA表達(dá)水平,并進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證,結(jié)合人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料和臨床資料,建立SLE及不同臨床亞型的血漿mi RNA表達(dá)譜,初步探討相關(guān)mi RNA在SLE發(fā)病中的分子機(jī)制。之后探討某些經(jīng)過驗(yàn)證異常表達(dá)的mi RNAs與三種細(xì)胞因子IL-6、IL-17和TNF-α的相關(guān)。本研究的完成將有助于確定SLE診斷和疾病分型的生物學(xué)標(biāo)5記,為最終發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。研究一SLE患者血漿micro RNA的差異表達(dá)及驗(yàn)證目的篩查并驗(yàn)證系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血漿micro RNA表達(dá)譜,探討micro RNA的表達(dá)與SLE發(fā)病及其病程的關(guān)聯(lián)性,為SLE的發(fā)病機(jī)制研究、早期預(yù)警、新的治療方向提供理論依據(jù)。方法本項(xiàng)目采用病例對(duì)照研究,通過收集SLE患者和正常對(duì)照的血液標(biāo)本,利用mi RNA芯片檢測其血漿mi RNA表達(dá)水平,并利用Real-time PCR方法進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證,結(jié)合人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料和臨床資料,建立SLE及不同臨床亞型的血漿mi RNA表達(dá)譜,探討異常表達(dá)的mi RNAs與SLE患者臨床特征間的關(guān)聯(lián)。從2012年10月開始收集新發(fā)SLE病例的血液標(biāo)本備用。SLE病例主要來自于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科和安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科。患者符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)的SLE分類標(biāo)準(zhǔn);選擇年齡、性別與SLE患者匹配的正常人作為對(duì)照組。第一階段擬收集SLE新發(fā)病例和對(duì)照各30例,用于mi RNA芯片檢測血漿中mi RNA的表達(dá)水平;第二階段擬重新收集SLE新發(fā)病例38例和對(duì)照40例,進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證。mi RNA芯片檢測數(shù)據(jù)使用Gene Pixpro 6.0提取分析,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)使用Real-time PCR方法檢測mi R-16-5p和mi R-101-3p表達(dá)量,以2-ΔCt表示目的mi RNA相對(duì)表達(dá)量。使用Epi Data 3.1建庫,雙人錄入資料,專人抽查核實(shí)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 10.01軟件進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果(1)mi RNA芯片的篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn),在SLE患者血漿中共篩選出97個(gè)基因表達(dá)上調(diào),182個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,最終篩選出差異表達(dá)的人類mi RNAs有158個(gè),其中表達(dá)上調(diào)有32個(gè)基因,表達(dá)下調(diào)有126個(gè)基因。(2)擴(kuò)大樣本量,設(shè)計(jì)引物對(duì)差異表達(dá)的人類mi RNAs其中的2個(gè)micro RNAs:mi R-16-5p和mi R-101-3p在SLE患者和正常對(duì)照中的表達(dá)水平進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)mi R-16-5p和mi R-101-3p在SLE患者血漿中的表達(dá)差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.001和0.005),與mi RNA芯片篩查預(yù)測的結(jié)果一致。(3)mi R-16-5p和mi R-101-3p血漿表達(dá)水平與SLE患者主要臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)的關(guān)聯(lián)研究中,發(fā)現(xiàn)皮疹陽性組與陰性組間、血小板降低組與非血小板降低組間的mi R-16-5p和mi R-101-3p表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)量和P值分別為Z皮疹=-2.368,P皮疹=0.017;Z血小板降低=-2.146,P血小板降低=0.032和Z皮疹=-2.046,P皮疹=0.041;Z血小板降低=-2.180,P血小板降低=0.029。(4)血漿中mi R-16-5p和mi R-101-3p的表達(dá)水平與SLE患者疾病活動(dòng)度的關(guān)聯(lián)研究,發(fā)現(xiàn)SLE患者疾病活動(dòng)度評(píng)分與mi R-16-5p和mi R-101-3p表達(dá)水平的相關(guān)性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均有P0.05)。(5)SLE患者血漿中mi R-16-5p、mi R-101-3p表達(dá)水平的相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)mi R-16-5p表達(dá)水平與mi R-101-3p表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.675,P0.001)。結(jié)論在SLE患者血漿mi RNA芯片的篩查中,最終篩選出差異表達(dá)的人類mi RNAs有158個(gè),其中表達(dá)上調(diào)的有32個(gè)基因,表達(dá)下調(diào)有126個(gè)基因。對(duì)mi R-16-5p、mi R-101-3p的Real-time PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與芯片篩查結(jié)果相符。在對(duì)血漿mi R-16-5p和mi R-101-3p表達(dá)水平與SLE患者臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的分析中,顯示mi R-16-5p和mi R-101-3p的表達(dá)均與皮疹和血小板降低相關(guān),提示這兩個(gè)mi RNAs可以作為潛在的診斷、判斷疾病預(yù)后或是復(fù)發(fā)情況的分子標(biāo)志物。研究二SLE患者血漿中mi R-16-5p和mi R-101-3p表達(dá)水平與IL-6、IL-17和TNF-α水平的相關(guān)性研究目的研究mi R-16-5p和mi R-101-3p在SLE患者血漿中的表達(dá)水平與IL-6、IL-17和TNF-α水平的關(guān)聯(lián)性,探討在SLE發(fā)病及其病程發(fā)展中這3種細(xì)胞因子與mi R-16-5p和mi R-101-3p的相互作用。方法研究對(duì)象SLE患者的選取標(biāo)準(zhǔn)同研究一,與研究一來源于同一樣本人群。ELISA實(shí)驗(yàn)最終檢測的樣本量為37例患者。SLE患者資料收集的內(nèi)容和方法同研究一。在獲得研究對(duì)象知情同意后,使用EDTA抗凝采血管抽取所有研究對(duì)象外周靜脈血5ml,3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離血漿處理。同時(shí)由專業(yè)人員對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行問卷調(diào)查,收集研究對(duì)象的一般情況和臨床資料,并進(jìn)行SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)評(píng)分。采用ELISA試劑盒檢測血漿中IL-6、IL-17和TNF-α的水平,對(duì)SLE患者中狼瘡腎炎患者和非狼瘡腎炎患者、疾病活動(dòng)期患者和非疾病活動(dòng)期患者之間血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平的差異及其與mi R-16-5p和mi R-101-3p在SLE患者血漿中表達(dá)水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。采用SPSS 10.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果(1)SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α的水平IL-6的血漿濃度為(18.15±7.82)pg/m L,IL-17的血漿濃度為(20.42±10.11)pg/m L,TNF-α的血漿濃度為(33.66±15.18)pg/m L。(2)SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α的水平與SLE患者主要臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)的關(guān)聯(lián)SLE患者管型尿與非管型尿組間的血漿IL-6水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.388,P=0.009);肌炎和非肌炎組、血小板降低組和血小板未降低組間的血漿IL-17水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t肌炎=-5.354,P肌炎0.001;t血小板降低=-2.267,P血小板降低=0.030);盤狀紅斑和非盤狀紅斑組間的TNF-α血漿水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.499,P0.001)。(3)SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α血漿水平與SLE患者疾病活動(dòng)度的關(guān)聯(lián)SLE患者血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與其疾病活動(dòng)度的關(guān)聯(lián)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均有P0.05)。(4)SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α水平與mi R-16-5p表達(dá)水平的相關(guān)性SLE患者血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與mi R-16-5p表達(dá)水平的相關(guān)性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均有P0.05);不同臨床癥狀間、不同實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)間的比較顯示,SLE患者非顴部紅斑組血漿TNF-α水平與mi R-16-5p表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.928,P0.001),關(guān)節(jié)炎組(r=-0.486,P=0.014)、抗Ribosomal P陽性組血漿TNF-α水平與mi R-16-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.488,P=0.047)。(5)SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α水平與mi R-101-3p表達(dá)水平的相關(guān)性SLE患者血漿中mi R-101-3p表達(dá)水平與IL-17水平呈正相關(guān)(r=0.329,P=0.047);盤狀紅斑陰性組、低補(bǔ)體陽性組、抗核抗體陽性組血漿IL-17水平與mi R-101-3p表達(dá)水平呈正相關(guān)(均有P0.05),管型尿陰性組、蛋白尿陰性組、膿尿陰性組、抗Ribosomal P陰性組IL-17血漿水平與mi R-101-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(均有P0.05);抗Ribosomal P陰性組血漿TNF-α水平與mi R-101-3p表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.448,P=0.048)。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿IL-17水平與mi R-101-3p表達(dá)水平相關(guān),未發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與mi R-16-5p表達(dá)水平相關(guān),但是血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與mi R-16-5p和mi R-101-3p表達(dá)水平在部分臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)之間存在關(guān)聯(lián)。
【關(guān)鍵詞】：紅斑狼瘡 系統(tǒng)性 microRNA表達(dá)譜篩查 Real-time PCR驗(yàn)證 病例對(duì)照研究 紅斑狼瘡 系統(tǒng)性 血漿 白細(xì)胞介素 腫瘤壞死因子-α 酶聯(lián)免疫吸附測定
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R593.241
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-13
• 英文摘要13-20
• 研究一 SLE患者血漿micro RNA的差異表達(dá)篩查及驗(yàn)證20-69
• 1 前言20-25
• 2 材料與方法25-41
• 3 結(jié)果41-64
• 4 討論64-68
• 5 結(jié)論68-69
• 研究二 SLE患者血漿中mi R165p和mi R1013p表達(dá)水平與IL-6、IL-17和TNF-α 水平的相關(guān)性研究69-116
• 1 前言69-71
• 2 材料與方法71-75
• 3 結(jié)果75-113
• 4 討論113-115
• 5 結(jié)論115-116
• 參考文獻(xiàn)116-129
• 附錄129-133
• 致謝133-135
• 綜述135-156
• 參考文獻(xiàn)146-156
• 附件 1156-158
• 附件 2158-159
• 附件 3159

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊玫;祝艷;張敏;劉娟;許望東;冷瑞雪;潘海峰;葉冬青;;Fli-1在外周血T/B細(xì)胞中的表達(dá)及其與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性研究[J];中華疾病控制雜志;2014年07期

  本文關(guān)鍵詞：系統(tǒng)性紅斑狼瘡血漿microRNA表達(dá)譜篩查與驗(yàn)證的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：323244