本文關(guān)鍵詞：脂聯(lián)素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激致血管鈣化過程中的作用及其機制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脂聯(lián)素(Adiponectin,APN)是由脂肪細胞所分泌的,是一種特異性的脂肪細胞因子,是調(diào)節(jié)機體代謝的因子之一,APN具有抗糖尿病、抗炎、抗纖維化、抗動脈粥樣硬化的作用,同時具有保護血管的生理效應。近年來國內(nèi)外的多項研究表明,APN可以通過抑制血管內(nèi)皮細胞的激活、抑制ERS誘導的細胞凋亡、促進內(nèi)皮細胞的修復等多種途徑發(fā)揮血管的保護作用,但其具體機制還有待于深入研究。本研究通過建立離體、在體鈣化模型,結(jié)合病理分析、分子生物學及細胞生物學等技術(shù),闡述APN通過減輕ERS所致的細胞凋亡進而減輕血管鈣化的作用,我們設(shè)計了以下實驗:第一部分脂聯(lián)素對大鼠血管鈣化的抑制作用目的:構(gòu)建大鼠鈣化模型,觀察APN對大鼠血管鈣化的抑制作用。方法:健康雄性SD大鼠隨機分為3組,每組各10只。分別為正常對照組(sham組):給予等量的生理鹽水肌注和單純花生油灌胃;鈣化組(VDN組):第一天8時維生素D3(300000U/kg)肌肉注射,尼古丁(25mg/kg)溶于花生油中進行灌胃(8時和18時各一次),第二天起以等量的蒸餾水灌胃;鈣化+脂聯(lián)素(globular Adiponectin,g Ad)組(VDN+g Ad組):模型制作同鈣化組,同時舌靜脈注射g Ad(1μg·kg-1/日)。三組動物常規(guī)飼養(yǎng)6周后稱重,用2%戊巴比妥鈉麻醉,摘取胸主動脈,結(jié)合病理分析(血管組織Von Kossa染色觀察血管鈣化程度)、胸主動脈鈣含量和ALP活性測定觀察鈣化程度、Real-time PCR和Western blot檢測血管平滑肌組織鈣化指標OPG、Runx2的基因和蛋白表達。結(jié)果:(1)Von Kossa染色顯示sham組未見鈣質(zhì)沉積,VDN組血管可見明顯的黑色顆粒鈣質(zhì)沉積、部分中膜彈力纖維紊亂斷裂,VDN+g Ad組僅可見少量黑色顆粒鈣質(zhì)沉積;與sham組相比,VDN組鈣含量和ALP活性明顯增高(P0.01),VDN+g Ad組與VDN組相比,鈣含量和ALP活性明顯降低(P0.05)。(2)與sham組相比,VDN組OPG m RNA表達明顯減少,Runx2m RNA表達明顯增加(P0.01);VDN+g Ad組與VDN組相比,OPG m RNA表達明顯增加,Runx2m RNA表達明顯減少(P0.01)。(3)與sham組相比,VDN組OPG蛋白表達明顯減少,Runx2蛋白表達明顯增加(P0.01);VDN+g Ad組與VDN組相比,OPG蛋白表達明顯增加,Runx2蛋白表達明顯減少(P0.01),提示g Ad可明顯逆轉(zhuǎn)Runx2蛋白表達的上調(diào),脂聯(lián)素可以減輕血管鈣化。結(jié)論:g Ad對大鼠血管鈣化有抑制作用。第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的凋亡促進血管鈣化目的:采用原代培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細胞制備鈣化模型,探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的凋亡對血管鈣化的促進作用。方法:原代培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC,制備鈣化模型,隨機分為4組:a.VSMC+正常培養(yǎng)(control組)b.VSMC+β-甘油磷酸鈉(β-GP組)c.VSMC+TG+β-甘油磷酸鈉(TG組)d.VSMC+4-PBA+β-甘油磷酸鈉(4-PBA組)結(jié)合Von Kossa染色觀察細胞鈣化、采用細胞鈣含量和ALP活性測定觀察細胞鈣化程度、TUNEL法和Caspase 3活性測定評估VSMC凋亡情況、Real-time PCR和Western blot檢測VSMC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、細胞凋亡、鈣化相關(guān)指標(GRP78、caspase12、CHOP、OPG、Runx2)的基因和蛋白表達。結(jié)果:(1)Von Kossa染色顯示細胞鈣化模型成功制備;與control組相比,β-GP組和TG組鈣含量與ALP活性顯著增高(P0.01),4-PBA組鈣含量與ALP活性明顯增高(P0.05);TG組與β-GP組相比,鈣含量與ALP活性明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);4-PBA組與β-GP組相比,鈣含量與ALP活性明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)control組偶見TUNEL陽性細胞,與control組相比,β-GP組、TG組TUNEL陽性細胞明顯增多(P0.01),caspase3活性顯著升高(P0.01),4-PBA組TUNEL陽性細胞明顯增多、caspase3活性明顯升高(分別P0.05);TG組凋亡細胞較β-GP組明顯增多,caspase3活性明顯升高(分別P0.05),4-PBA組較β-GP組TUNEL陽性細胞顯著減少、caspase3活性顯著降低(P0.05)。(3)與control組相比,β-GP組和TG組GRP78、CHOP、caspase12及Runx2 m RNA和蛋白表達顯著增加,OPGm RNA和蛋白表達顯著減少(分別P0.01);TG組與β-GP組相比,GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表達顯著增加,OPGm RNA和蛋白表達顯著減少(分別P0.05),4-PBA組與β-GP組相比,GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表達明顯被抑制,OPGm RNA和蛋白表達顯著增加(分別P0.05)。結(jié)論:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的凋亡促進血管鈣化。第三部分脂聯(lián)素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激致細胞凋亡導致血管鈣化中的作用(一)動物體內(nèi)實驗探討脂聯(lián)素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激致細胞凋亡導致血管鈣化中的作用目的:采用在體大鼠血管鈣化模型,探討脂聯(lián)素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激致細胞凋亡導致血管鈣化中的作用。方法:健康雄性SD大鼠隨機分為3組,每組各10只,實驗分組同實驗一。采用胸主動脈鈣含量和ALP活性測定觀察鈣化程度、TUNEL法和Caspase 3活性測定評估VSMC凋亡情況、Real-time PCR和Western blot檢測血管平滑肌組織ERS、細胞凋亡、鈣化相關(guān)指標(GRP78、Caspase12、CHOP、OPG、Runx2)的基因和蛋白表達。結(jié)果:(1)與sham組相比,VDN組鈣含量和ALP活性明顯增高(P0.01),VDN+g Ad組與VDN組相比,其鈣含量和ALP活性明顯降低(P0.05),提示外源性給予脂聯(lián)素后,血管鈣化明顯減輕。(2)sham組極少見TUNEL陽性細胞,與sham組相比,VDN組和VDN+g Ad組TUNEL陽性細胞顯著增多、caspase3活性顯著升高(分別P0.01),VDN+g Ad組較VDN組TUNEL陽性細胞顯著減少、caspase3活性顯著降低(分別P0.05),提示外源性給予脂聯(lián)素后,平滑肌細胞凋亡明顯減少。(3)與sham組相比,VDN組Caspase12、CHOP、GRP78及Runx2 m RNA和蛋白表達顯著增加、OPGm RNA和蛋白表達顯著減少(分別P0.01),給予脂聯(lián)素處理后,GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表達明顯被抑制,OPGm RNA和蛋白表達顯著增高(P0.05),提示g Ad處理后可明顯逆轉(zhuǎn)GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表達的上調(diào)。結(jié)論:g Ad可減輕大鼠血管鈣化,與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡有關(guān)。(二)細胞水平驗證脂聯(lián)素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所致的細胞凋亡減輕血管鈣化目的:采用離體原代培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC鈣化模型,驗證脂聯(lián)素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所致的細胞凋亡減輕血管鈣化。方法:原代培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC,隨機分為6組:a.control組b.g Ad(2μg/ml)組c.β-GP組d.β-GP+g Ad(0.5μg/ml)組e.β-GP+g Ad(1μg/ml)組f.β-GP+g Ad(2μg/ml)組采用細胞鈣含量和ALP活性測定判斷細胞鈣化程度、TUNEL法和Caspase 3活性測定評估VSMC凋亡情況、Real-time PCR和Western blot檢測VSMC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、細胞凋亡、鈣化相關(guān)指標(GRP78、caspase12、CHOP、OPG、Runx2)的基因和蛋白表達。結(jié)果:(1)β-GP組鈣含量和ALP活性與control組相比差異性顯著(P0.01),與β-GP組相比,β-GP+g Ad 1μg/ml組、β-GP+g Ad 2μg/ml組鈣含量與ALP活性顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(分別P0.05)。(2)control組及g Ad組偶見細胞凋亡,β-GP組TUNEL陽性細胞明顯增多、caspase3活性顯著升高;與β-GP組相比,β-GP+g Ad1μg/ml組、β-GP+g Ad 2μg/ml組TUNEL陽性細胞明顯降低,caspase3活性顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)與control組相比,β-GP組和β-GP+g Ad 0.5μg/ml組GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表達顯著增加,OPGm RNA和蛋白表達顯著降低(分別P0.01);與β-GP組相比,β-GP+g Ad 1μg/ml組、β-GP+g Ad2μg/ml組GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表達顯著降低,OPGm RNA和蛋白表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。提示外源性給予g Ad可以減輕平滑肌細胞鈣化。其中以2μg/ml的濃度為佳,說明g Ad的血管保護作用具有濃度依賴性。結(jié)論:g Ad可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡而減輕平滑肌細胞鈣化,且這種作用具有濃度依賴性。
【關(guān)鍵詞】：脂聯(lián)素 平滑肌細胞 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 細胞凋亡 血管鈣化
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中文摘要7-13
• 英文摘要13-20
• 常用縮寫詞中英文對照表20-21
• 前言21-27
• 參考文獻25-27
• 第一部分 脂聯(lián)素對大鼠血管鈣化的抑制作用27-47
• 引言27
• 1 材料與方法27-37
• 1.1 主要試劑27-28
• 1.2 主要儀器28-29
• 1.3 主要溶液的配置29-30
• 1.4 實驗方法30-36
• 1.5 統(tǒng)計學方法36-37
• 2 結(jié)果37-41
• 2.1 胸主動脈Von Kossa染色情況37
• 2.2 胸主動脈鈣含量及ALP活性的測定37-38
• 2.3 大鼠主動脈血管平滑肌組織OPG、Runx2 mRNA的表達測定38-39
• 2.4 大鼠主動脈血管平滑肌組織OPG、Runx2 蛋白表達的測定39-41
• 3 討論41-43
• 4 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-47
• 第二部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的凋亡促進血管鈣化47-73
• 引言47
• 1 材料與方法47-57
• 1.1 主要試劑47-48
• 1.2 主要實驗儀器48-49
• 1.3 主要溶液的配置49
• 1.4 實驗方法49-56
• 1.5 統(tǒng)計學處理56-57
• 2 結(jié)果57-67
• 2.1 大鼠主動脈平滑肌細胞的培養(yǎng)及鑒定57-58
• 2.2 鈣化主動脈平滑肌細胞的形態(tài)學分析58-59
• 2.3 各組細胞層鈣含量及ALP活性測定59
• 2.4 平滑肌細胞凋亡59-61
• 2.5 各組平滑肌細胞GRP78、Caspase12、CHOP的mRNA表達61-62
• 2.6 各組平滑肌細胞OPG、Runx2 的mRNA表達62-63
• 2.7 各組平滑肌細胞GRP78、Caspase12、CHOP的蛋白表達63-65
• 2.8 各組平滑肌細胞OPG、Runx2 的蛋白表達65-67
• 3 討論67-69
• 4 結(jié)論69-70
• 參考文獻70-73
• 第三部分 脂聯(lián)素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激致細胞凋亡導致血管鈣化中的作用73-97
• 引言73-74
• （一） 動物體內(nèi)實驗探討脂聯(lián)素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激致細胞凋亡導致血管鈣化中的作用74-82
• 1 材料與方法74-77
• 1.1 主要試劑74
• 1.2 主要實驗儀器74
• 1.3 主要溶液的配置74
• 1.4 實驗方法74-76
• 1.5 統(tǒng)計學處理76-77
• 2 結(jié)果77-82
• 2.1 各組胸主動脈鈣含量和ALP活性的測定77
• 2.2 平滑肌細胞凋亡測定77-79
• 2.3 脂聯(lián)素對平滑肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、凋亡相關(guān)指標mRNA表達的影響79-80
• 2.4 脂聯(lián)素對平滑肌細胞鈣化相關(guān)指標mRNA表達的影響80
• 2.5 脂聯(lián)素對平滑肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、凋亡相關(guān)指標蛋白表達的影響80-82
• 2.6 脂聯(lián)素對平滑肌細胞鈣化相關(guān)指標蛋白表達的影響82
• （二）細胞水平驗證脂聯(lián)素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所致的細胞凋亡減輕血管鈣化82-97
• 1 材料與方法82-84
• 1.1 主要試劑82
• 1.2 實驗儀器82
• 1.3 實驗溶液的配置82
• 1.4 實驗方法82-83
• 1.5 統(tǒng)計分析83-84
• 2 結(jié)果84-93
• 2.1 各組細胞鈣含量及ALP活性測定84
• 2.2 平滑肌細胞凋亡84-87
• 2.3 脂聯(lián)素對平滑肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、凋亡相關(guān)指標mRNA表達的影響87-88
• 2.4 脂聯(lián)素對平滑肌細胞鈣化相關(guān)指標mRNA表達的影響88-89
• 2.5 脂聯(lián)素對平滑肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、凋亡相關(guān)指標蛋白表達的影響89-91
• 2.6 脂聯(lián)素對平滑肌細胞鈣化相關(guān)指標蛋白表達的影響91-93
• 3 討論93-96
• 4 結(jié)論96-97
• 參考文獻97-100
• 全文總結(jié)100-101
• 綜述101-111
• 參考文獻106-111
• 致謝111-112
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果112-113
• 個人簡歷113

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