本文關鍵詞：調(diào)節(jié)性T細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景免疫炎癥反應是創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)損傷中繼發(fā)損傷的重要因素,貫穿繼發(fā)損傷的始終。過去十多年隨著神經(jīng)免疫學的發(fā)展,免疫反應在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用得到了廣泛的研究,但并未得出一致性的結論。傳統(tǒng)的觀點認為CNS是免疫豁免器官,任何浸潤其中的外周免疫細胞都是有害的,應當予以抑制以減輕繼發(fā)損傷[1];而其它研究發(fā)現(xiàn)CNS損傷后主動或被動用CNS自身抗原免疫動物提高自身免疫T細胞的數(shù)量和活性都能明顯增加損傷后神經(jīng)元的存活,促進神經(jīng)功能的恢復[2],但具有這種保護作用的T細胞的具體亞型仍不清楚。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)是一類自然產(chǎn)生的能控制體內(nèi)自身免疫反應的T細胞亞群,表達轉(zhuǎn)錄因子Foxp3,對自身抗原有很高的親和力,通過直接接觸或分泌抗炎因子IL-10,TGFβ等抑制T細胞的增殖和活化[3]。近年對調(diào)節(jié)性T細胞的研究主要集中在腫瘤和自身免疫性疾病中,CNS損傷后Treg細胞的作用及其機制,以及其對于CNS損傷后免疫反應的作用如何尚不清楚。免疫反應按參與的細胞和反應時序不同可分為固有免疫反應和適應性免疫反應,二者之間相互聯(lián)系,相互作用,共同維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。巨噬細胞是機體一大類重要的固有免疫細胞,在損傷修復過程中起著重要的作用。CNS損傷后損傷區(qū)有兩種不同來源的巨噬細胞,一種是CNS固有的小膠質(zhì)細胞活化產(chǎn)生,一種是血液單核細胞浸潤至損傷區(qū)產(chǎn)生,這兩種細胞在形態(tài)和表面標記上目前都無法區(qū)分,因此被統(tǒng)稱為巨噬/小膠質(zhì)細胞[4],但它們在損傷后的具體作用是否完全一致仍有待研究。巨噬細胞在不同的細胞因子環(huán)境下能向不同方向極化,進而產(chǎn)生不同的作用。在LPS和IFN-γ存在的條件下細胞通過經(jīng)典活化途徑向M1方向活化,產(chǎn)生TNFα和IL-1β等促炎因子,并高表達誘導型一氧化氮合梅(i NOS),產(chǎn)生大量氧自由基。而在IL-4和IL-13的作用下,細胞則向M2方向活化,產(chǎn)生IL-10和TGFβ等抗炎因子,并高表達精氨酸酶1(arginase1)同i NOs競爭底物精氨酸,能促進細胞增殖和組織重塑[5]。研究顯示CNS損傷后而M2型活化的巨噬細胞有神經(jīng)保護作用[6]。但具體是何種因素誘導和維持巨噬細胞的這種表型現(xiàn)在仍不清楚。目的1.研究CNS損傷后的免疫反應類型;2.研究調(diào)節(jié)性T細胞在CNS損傷中的作用及其機制;3.觀察CNS損傷后損傷區(qū)小膠質(zhì)細胞來源的巨噬細胞和血液單核細胞來源的巨噬細胞之間的差異,及其對損傷恢復的影響。方法1.采用視神經(jīng)夾傷模型,計數(shù)熒光金逆行標記的視網(wǎng)膜節(jié)細胞(retinal ganglion cell,RGC),采用脊髓中度撞擊傷模型(100k Dy),用BMS(Basso Mouse Scale)標準評估小鼠后肢運動功能恢復的情況;2.給予地塞米松腹腔注射抑制免疫反應觀察其對CNS損傷后神經(jīng)元存活和神經(jīng)功能恢復的影響,摘除CNS引流淋巴結,觀察其對視神經(jīng)損傷后RGC存活的影響;3.流式細胞術檢測CNS損傷后不同淋巴結內(nèi)CD4+T細胞(CD45+TCRβ+CD4+),CD8+T細胞(CD45+TCRβ+CD8+),調(diào)節(jié)性T細胞(CD45+TCRβ+CD4+CD25+Foxp3+),效應T細胞(CD45+TCRβ+CD4+CD25+Foxp3-)的數(shù)量和比例;4.清除調(diào)節(jié)性T細胞的方法:采用CD25單克隆抗體(克隆號:PC61)腹腔注射,或采用DEREG轉(zhuǎn)基因小鼠(在foxp3基因啟動子下帶有白喉毒素受體基因)腹腔注射白喉毒素以清除表達foxp3和白喉毒素受體的調(diào)節(jié)性T細胞;5.增加調(diào)節(jié)性T細胞的方法:尾靜脈回輸體外全反式視黃酸(all-trans retinoic acid,ATRA)和TGF-β誘導培養(yǎng)的調(diào)節(jié)性T細胞;6.采用嵌合體小鼠(UBC-GFP小鼠的骨髓移植進輻照過的野生型小鼠體內(nèi),血液來源的細胞均表達GFP,而CNS固有的小膠質(zhì)細胞不表達GFP),CCR2 KO小鼠以及CCR2-RFP轉(zhuǎn)基因小鼠觀察CNS損傷區(qū)巨噬細胞arginase-1的表達情況;7.免疫組織化學染色檢測損傷區(qū)CD4+T細胞,CD11b+巨噬細胞,Foxp3+細胞的數(shù)目,以及arginase-1的表達情況;8.q PCR檢測損傷區(qū)炎癥因子,arginase-1,以及nos2等基因的表達情況;結果1.視神經(jīng)損傷后,頸深淋巴結內(nèi)CD4+T細胞比例和數(shù)目均明顯增多而CD8+T細胞比例降低,頸深淋巴結內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞和效應T細胞的比例相對于損傷后皮膚引流淋巴結以及未損傷組的頸深淋巴結均升高。頸深淋巴結內(nèi)CD4+T細胞IL-4表達增多,能促使體外培養(yǎng)的骨髓來源巨噬細胞表達arginase-1;2.摘除頸深淋巴結小鼠視神經(jīng)損傷后RGC存活明顯減少;地塞米松抑制免疫反應,其處理組視神經(jīng)損傷后RGC的存活明顯少于對照組,其脊髓損傷后后肢運動功能BMS評分也明顯低于對照組,3.調(diào)節(jié)性T細胞對CNS損傷的作用有劑量差異效應,即用25μg PC61抗體或4μg/kg白喉毒素少量清除調(diào)節(jié)性T細胞能明顯增加存活的神經(jīng)元數(shù)目,而用250μg PC61或40μg/kg白喉毒素大量或完全清除調(diào)節(jié)性T細胞則產(chǎn)生相反的作用。實驗中神經(jīng)元的存活同損傷區(qū)arginase-1的表達相關,即低劑量清除調(diào)節(jié)性T細胞使損傷區(qū)arginase-1的表達明顯增加,而大量清除調(diào)節(jié)性T細胞后視神經(jīng)損傷區(qū)arginase-1的表達明顯減少;4.靜脈回輸體外誘導培養(yǎng)的調(diào)節(jié)性T細胞能明顯減少視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜節(jié)細胞的存活,同時其損傷區(qū)表達arginase-1的巨噬細胞比例減少,且損傷區(qū)抗炎因子IL-10的表達也明顯減少;5.嵌合體小鼠CNS損傷后損傷區(qū)arginase-1+的細胞大部分都為GFP+,CCR2 KO小鼠CNS損傷后損傷區(qū)缺乏arginase-1+的細胞,且CCR2-RFP小鼠脊髓損傷后損傷區(qū)arginase1+的細胞多為RFP+;6.CCR2 KO小鼠在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜節(jié)細胞的存活以及脊髓損傷后運動功能的恢復方面均明顯差于野生型小鼠。結論1.CNS損傷后外周的免疫反應主要發(fā)生在其引流淋巴結頸深淋巴結內(nèi),表現(xiàn)為以CD4+T細胞為主導的免疫反應,調(diào)節(jié)性T細胞和效應T細胞均有增加,并且這種免疫反應具有神經(jīng)保護作用;2.調(diào)節(jié)性T細胞對CNS損傷后的保護性免疫反應具有抑制作用,增加調(diào)節(jié)性T細胞能抑制免疫反應對CNS損傷的保護作用;而適當減少調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)目,減輕其對保護性免疫反應的抑制,能提高CNS損傷后神經(jīng)元的存活,但過分減少調(diào)節(jié)性T細胞可能使免疫反應過度活化而產(chǎn)生相反的作用,提示臨床上應用調(diào)節(jié)性T細胞治療CNS損傷應尤為謹慎;3.CNS損傷后調(diào)節(jié)性T細胞并不進入損傷區(qū),而可能是在外周直接或間接作用于單核細胞,改變進入損傷區(qū)的單核巨噬細胞的極化狀態(tài)而發(fā)揮其作用的;4.CNS損傷后損傷區(qū)arginase-1主要表達在血源性單核細胞來源的巨噬細胞上,而小膠質(zhì)細胞幾乎不表達arginase-1,且單核細胞來源的巨噬細胞具有神經(jīng)保護作用。
【關鍵詞】：CNS損傷 調(diào)節(jié)性T細胞 保護性自身免疫反應 巨噬細胞 精氨酸酶1
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-17
• 前言17-20
• 文獻回顧20-32
• 第一部分 CNS損傷后的保護性免疫反應32-49
• 1 材料32-33
• 2 方法33-38
• 3 結果38-47
• 3.1 CNS損傷后外周的免疫反應變化38-43
• 3.2 CNS損傷后的免疫反應具有神經(jīng)保護作用43-47
• 4 討論47-49
• 第二部分 調(diào)節(jié)性T細胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷恢復的影響及其機制49-75
• 1 材料49-50
• 2 方法50-55
• 3 結果55-72
• 3.1 減少調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)目對CNS損傷的影響55-66
• 3.2 外源性調(diào)節(jié)性T細胞抑制CNS保護性免疫反應66-72
• 4 討論72-75
• 第三部分 CNS損傷區(qū)不同來源巨噬細胞ARGINASE-1 的表達75-84
• 1 材料75
• 2 方法75-76
• 3 結果76-83
• 3.1 CNS損傷區(qū)arginase-1 主要表達在血液單核細胞來源的巨噬細胞上76-82
• 3.2 血源性巨噬細胞具有神經(jīng)保護作用82-83
• 4 討論83-84
• 小結84-85
• 參考文獻85-98
• 附錄98-99
• 個人簡歷和研究成果99-100
• 致謝100

【共引文獻】

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本文編號：318432