本文關(guān)鍵詞：高尿酸誘導(dǎo)血管鈣化的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:尿酸(UA)是嘌呤代謝產(chǎn)物。人類(lèi)在進(jìn)化的過(guò)程當(dāng)中,由于尿酸酶的基因發(fā)生變異,致使其功能失活,使得人血UA濃度顯著高于其它哺乳類(lèi)動(dòng)物。近年來(lái),大量的臨床調(diào)查及循證實(shí)踐證實(shí)高尿酸血癥(HUA)是心腦血管系統(tǒng)疾病獨(dú)立的危險(xiǎn)因子。血管鈣化(VC)可導(dǎo)致血管脆性及僵硬度增加,增添了動(dòng)脈斑塊、血管破裂及動(dòng)脈瘤形成的危險(xiǎn)性,是導(dǎo)致心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管事件的重要危險(xiǎn)因子。高尿酸是否通過(guò)誘導(dǎo)血管鈣化參與動(dòng)脈硬化的發(fā)生和發(fā)展,從而誘發(fā)各種心血管疾病值得探討。血管鈣化與血管壁細(xì)胞,尤其是血管的平滑肌細(xì)胞在各類(lèi)刺激因素作用下活化,轉(zhuǎn)化成為成骨樣細(xì)胞密切相關(guān)。大量研究證實(shí)UA可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖及氧化應(yīng)激。高尿酸是否通過(guò)誘導(dǎo)VSMC分化成為成骨樣細(xì)胞,從而導(dǎo)致VC目前尚不清楚,對(duì)其進(jìn)行深入研究,勢(shì)在必行。前期工作中,課題組在國(guó)際上首次在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥導(dǎo)致以早期出現(xiàn)彌漫性血管鈣化為特征的動(dòng)脈硬化的直接證據(jù)�；谠摪l(fā)現(xiàn),本課題擬對(duì)高尿酸血癥導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的機(jī)制進(jìn)行研究。第一部分尿酸誘導(dǎo)大鼠原代平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化目的:探討尿酸是否可以在一般培養(yǎng)環(huán)境中刺激血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。方法:分離、培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白鑒定VSMC。(1)含不同濃度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞24h,48h和72h后,CCK-8法檢測(cè)UA對(duì)VSMC增殖的影響。(2)含不同濃度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞,分別作用3天,7天,14天,每3天換液一次。采用堿性磷酸酶(ALP)試劑盒微量酶標(biāo)法測(cè)定培養(yǎng)液中的ALP活性,并通過(guò)細(xì)胞蛋白定量計(jì)算相應(yīng)的ALP活性值。(3)將大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞接種于24孔板,在含不同濃度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天,用茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色。(4)將大鼠VSMC接種于6孔板,在含不同濃度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總RNA,Real-Time PCR(RT-PCR)檢測(cè)成骨細(xì)胞骨樣標(biāo)志物Runx2、BMP-2、OPN m RNA水平變化及平滑肌表型標(biāo)志物SM22αm RNA水平變化。(5)將大鼠VSMC接種于6孔板,在含不同濃度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總蛋白,蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)法檢測(cè)細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)。結(jié)果:(1)血管平滑肌細(xì)胞在尿酸濃度200μmol/L及400μmol/L作用下,細(xì)胞增殖,且呈濃度與時(shí)間依賴(lài)性。尿酸濃度在800μmol/L時(shí),其增殖作用相比400μmol/L有減弱趨勢(shì)。(2)尿酸濃度為800μmol/L時(shí),在作用7天和14天時(shí)ALP活性明顯增強(qiáng),且隨著時(shí)間增加,其增加效果越明顯。但UA200μmol/L和400μmol/L,ALP活性隨作用時(shí)間增加趨勢(shì)不明顯。(3)茜素紅染色未見(jiàn)顯著礦化結(jié)節(jié)出現(xiàn)。(4)成骨樣標(biāo)志物Runx2,BMP-2,OPN的m RNA水平在尿酸濃度800μmol/L明顯增高。平滑肌表型標(biāo)志物SM22α各組見(jiàn)未有明顯差異。(5)尿酸800μmol/L時(shí),Runx2蛋白表達(dá)明顯增高,其他濃度Runx2表達(dá)增高不明顯。結(jié)論:尿酸可誘導(dǎo)VSMC增殖,高濃度尿酸可誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞標(biāo)志物Runx2,BMP-2,OPN的m RNA表達(dá),提示尿酸有誘導(dǎo)大鼠原代胸主動(dòng)脈VSMC向成骨樣細(xì)胞分化的趨勢(shì)。第二部分尿酸促進(jìn)大鼠原代胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化及礦化目的:探討在成骨誘導(dǎo)劑存在的前提下,尿酸促進(jìn)VSMC成骨樣分化及礦化的能力。方法:(1)含不同濃度尿酸(0,200,400和800μmol/L)+成骨誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞24h,48h和72h后,CCK-8檢測(cè)尿酸對(duì)VSMC增殖的影響。(2)尿酸濃度0μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,200μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,作用14天,ALP試劑盒檢測(cè)相應(yīng)的ALP活性。(3)將大鼠VSMC接種于24孔板,在含不同濃度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天,用Von Kossa染色試劑盒進(jìn)行鈣鹽沉積染色。(4)將大鼠VSMC接種于24孔板,在含不同濃度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天,用茜素紅進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色并進(jìn)行定量鈣鹽分析。(5)將大鼠VSMC接種于6孔板,在含不同濃度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總RNA,Real-Time PCR檢測(cè)檢測(cè)成骨細(xì)胞骨樣標(biāo)志物Runx2、BMP-2、OPNm RNA水平變化及平滑肌表型標(biāo)志物SM22αm RNA水平變化。(6)將大鼠VSMC接種于6孔板,在含不同濃度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總蛋白,Western Blotting方法檢測(cè)細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)。結(jié)果:(1)VSMC在尿酸濃度200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L聯(lián)合成骨誘導(dǎo)劑作用下,細(xì)胞增殖,且呈濃度與時(shí)間依賴(lài)性。(2)尿酸作用于VSMC后ALP活性在尿酸濃度為400μmol/L、800μmol/L時(shí)明顯增高,且呈濃度依賴(lài)性增長(zhǎng)。(3)Von Kossa染色結(jié)果顯示,各組均有鈣鹽沉積,肉眼可見(jiàn)有尿酸(200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨誘導(dǎo)劑組較對(duì)照組顏色稍深。(4)茜素紅染色各組均有染色陽(yáng)性的橘黃色沉淀,肉眼觀察UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑組染色最明顯。定量分析結(jié)果可見(jiàn)鈣鹽沉積呈尿酸濃度依賴(lài)性增長(zhǎng)。(5)成骨樣細(xì)胞標(biāo)志物Runx2,BMP-2,OPN的m RNA表達(dá)在尿酸濃度400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑明顯增高,且呈濃度依賴(lài)性。平滑肌表型標(biāo)志物SM22α在800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑組較對(duì)照組明顯減少。(6)尿酸400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑組,800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑組,Runx2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增高,且呈濃度依賴(lài)性。結(jié)論:在成骨誘導(dǎo)劑存在時(shí),高濃度尿酸可明顯促進(jìn)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化及礦化。第三部分尿酸通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化目的:探討尿酸促進(jìn)大鼠VSMC細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化的機(jī)制。方法:(1)VSMC在不同濃度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,48h后,進(jìn)行ROS熒光探針-DHE染色及DAPI核染色。(2)實(shí)驗(yàn)分組UA0μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA200μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+Dkk-1,UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+CHIR98014。連續(xù)培養(yǎng)14天,測(cè)相應(yīng)的ALP活性。(3)將大鼠VSMC接種于6孔板。分組:UA0μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA200μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+Dkk-1,UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+CHIR98014,連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總RNA,Real-Time PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞骨樣標(biāo)志物m RNA水平變化。(4)將大鼠VSMC接種于6孔板。分組:UA0μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA200μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑,UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+Dkk-1,UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+CHIR98014,連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總蛋白,Western Blotting法檢測(cè)細(xì)胞β-catenin,Runx2蛋白表達(dá)。結(jié)果:(1)DHE染色結(jié)果顯示,隨著尿酸濃度增加,VSMC內(nèi)紅色熒光亮度逐漸增強(qiáng),提示尿酸可誘導(dǎo)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ROS生成,且其促進(jìn)作用呈濃度依賴(lài)性。尿酸作用24h,48h,DHE染色隨時(shí)間同樣濃度有加深,呈時(shí)間依賴(lài)性。(2)尿酸800μmol/L加入Wnt/β-catenin通路抑制劑Dkk-1后,ALP活性明顯降低,尿酸800μmol/L加入Wnt/β-catenin通路激活劑CHIR后,ALP活性略有升高。(3)尿酸800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑在加入Wnt/β-catenin通路抑制劑Dkk-1后,Runx2、BMP-2、OPN的m RNA表達(dá)較單純尿酸800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑組均明顯降低。(4)尿酸800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+Dkk1組抑制了平滑肌細(xì)胞β-catenin,Runx2蛋白表達(dá),而尿酸800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+CHIR組促進(jìn)了平滑肌細(xì)胞β-catenin,Runx2蛋白表達(dá)。結(jié)論:尿酸部分通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：尿酸 平滑肌細(xì)胞 成骨樣細(xì)胞 成骨誘導(dǎo)劑 Wnt/β-catenin信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5;R589.7
【目錄】：

• 摘要2-6
• Abstract6-12
• 縮略詞表12-16
• 引言16-23
• 參考文獻(xiàn)20-23
• 第一部分 尿酸誘導(dǎo)大鼠原代平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化23-52
• 前言23-24
• 材料與方法24-40
• 結(jié)果40-47
• 討論47-50
• 參考文獻(xiàn)50-52
• 第二部分 尿酸促進(jìn)大鼠原代平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化及礦化52-80
• 前言52-53
• 材料與方法53-68
• 結(jié)果68-75
• 討論75-78
• 參考文獻(xiàn)78-80
• 第三部分 尿酸通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化80-105
• 前言80-82
• 材料與方法82-95
• 結(jié)果95-99
• 討論99-102
• 參考文獻(xiàn)102-105
• 全文結(jié)論105-106
• 系統(tǒng)回顧與Meta分析：高尿酸血癥與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病106-127
• 參考文獻(xiàn)123-127
• 綜述：尿酸與心血管疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展127-138
• 參考文獻(xiàn)133-138
• 攻讀學(xué)位期間主要研究成果138-140
• 致謝140-142

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 邵文;李書(shū)國(guó);;血管平滑肌細(xì)胞與血管鈣化機(jī)制的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2013年16期

2 羅磊;譚鋼;康鵬德;廉永運(yùn);裴福興;;Wnt信號(hào)通路抑制因子DKK-1在骨質(zhì)疏松發(fā)生中的研究進(jìn)展[J];中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志;2010年05期

  本文關(guān)鍵詞：高尿酸誘導(dǎo)血管鈣化的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：318082