本文關(guān)鍵詞：Caveolin-1及ERM在TNF-α致大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞高通透性中的作用機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的肺微血管內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血氣屏障的重要結(jié)構(gòu)之一,其通透性的增加是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)的重要病理生理基礎(chǔ)。肺微血管內(nèi)皮細胞在炎癥因子的作用下一方面內(nèi)皮細胞本身發(fā)生水腫,使得血氣屏障的厚度增加導(dǎo)致彌散效率下降,另一方面大量炎癥細胞發(fā)生肺內(nèi)“扣押”,聚集的炎癥細胞發(fā)生活化,釋放大量炎性介質(zhì),這些炎性介質(zhì)可直接損傷微血管內(nèi)皮細胞,同時炎癥介質(zhì)可激活更多炎癥細胞,從而導(dǎo)致級聯(lián)放大的炎癥效應(yīng)產(chǎn)生。炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的大量炎癥因子可使肺微血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡,也可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞骨架的重組以及細胞間連接蛋白發(fā)生改變,從而導(dǎo)致細胞間隙增大,細胞屏障功能受損,細胞單層通透性增加。小窩蛋白(caveolin)作為小窩(caveolae)的結(jié)構(gòu)性蛋白,其腳手架(scaffolding domain)能與多種信號分子結(jié)合,從而賦予小窩信號轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐的作用。埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin,ERM)組成了ERM蛋白家族,三個蛋白的N端氨基酸序列(FERM)具有高度同源性,并且FERM將細胞骨架F-actin與膜相蛋白相連,從而調(diào)節(jié)多種信號通路,如細胞遷移、生長和粘附等。ERM的活化主要通過其C端的結(jié)構(gòu)域與自身或者另外一個單體的FERM結(jié)構(gòu)域相結(jié)合,形成單聚體或者同源、異源二聚體。這種分子間的相互作用導(dǎo)致的頭尾相連,掩蓋了ERM蛋白中膜蛋白和骨架蛋白的結(jié)合位點,從而使ERM處于失活狀態(tài)。本研究擬通過觀察抑制caveolin-1的表達對TNF-α致RPMVECs單層高通透性的調(diào)節(jié)以及對RPMVEC骨架重組和ERM磷酸化的影響,探討caveolin-1的作用;再通過抑制moesin的表達初步研究moesin在TNF-α致傷RPMVECs中的作用。方法1.體外分離、培養(yǎng)原代RPMVECs并鑒定。2.利用transwell分別構(gòu)建體外caveolin-1低表達和正常表達的RPMVECs單層細胞模型。按照相應(yīng)的實驗分組給予不同的刺激后檢測跨內(nèi)皮細胞電阻(transendothelial electrical resistance,TER)變化和對牛血清白蛋白的通透性變化。3.利用激光共聚焦顯微鏡觀察RPMVECs在給予不同藥物刺激后骨架蛋白F-actin和磷酸化ERM的變化。4.通過western blot檢測不同實驗分組中ERM磷酸化水平改變。5.構(gòu)建靶向moesin的載體質(zhì)粒,并包裝相應(yīng)慢病毒感染RPMVECs下調(diào)moesin的表達。6.分別檢測moesin低表達和正常表達的RPMVECs構(gòu)建的細胞單層受到TNF-α刺激后TER的改變。結(jié)果1.體外成功分離培養(yǎng)RPMVECs,經(jīng)形態(tài)學(xué)、FITC-植物血凝素結(jié)合試驗和CD34染色證實。2.原代RPMVECs感染慢病毒后48小時在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白(GFP)表達72小時后GFP表達強度進一步增大。感染caveolin-1-sh RNA lentivirus的RPMVECs總caveolin-1表達于感染后48小時開始降低,72小時達到最低值,約為初始的21±6%。陰性對照組caveolin-1表達無顯著變化。3.Caveolin-1低表達的細胞單層模型正常狀態(tài)下TER較陰性對照組TER略有升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有給予刺激的組別其TER于15min開始降低,3小時降低至最大值。抑制caveolin-1表達能夠減輕TNF-α和PKC激動劑PMA誘導(dǎo)的TER降低。低表達caveolin-1的細胞單層預(yù)先給予PKC抑制劑BIM作用2小時再給予TNF-α刺激相對于給予同樣處理的caveolin-1表達正常細胞單層,其電阻降低進一步減輕�？偟膩碚fPKC抑制劑BIM可減輕TNF-α導(dǎo)致的跨細胞單層電阻降低,抑制caveolin-1表達后可在此基礎(chǔ)上進一步減輕但仍然低于正常組。TNF-α和PMA作用RPMVECs 4h后,RPMVECs單層對FITC-BSA通透性增加至陰性對照組的8倍。PKC抑制劑BIM顯著降低TNF-α致RPMVECs單層對FITC-BSA的通透性,但仍然高于正常對照組。4.未給予任何刺激的RPMVECs中,F-actin主要分布于細胞外周近細胞膜處;未見F-actin聚集為粗大的張力纖維。同時細胞內(nèi)可檢測到少量磷酸化ERM表達,均勻彌散分布于整個細胞內(nèi),并且RPMVECs感染慢病毒和下調(diào)caveolin-1的表達對RPMVECs中F-actin以及ERM的磷酸化水平影響不明顯,與正常對照組(normal組)無明顯差異。5.給予低表達caveolin-1的RPMVECs TNF-α刺激2h后,F-actin較正常組(control-sh RNA組)形成增加,但與陰性對照刺激組(control-sh RNA+TNF-α組)相比,F-actin形成顯著減少,跨細胞應(yīng)力纖維形成不明顯;ERM磷酸化水平增加程度不及正常組(control-sh RNA組)但較陰性對照刺激組(control-sh RNA+TNF-α組)明顯減少。6.PKC激動劑PMA作用于caveolin-1正常表達的RPMVECs后可見F-actin聚集,應(yīng)力纖維形成,ERM磷酸化顯著增加(與normal組相比),而PMA作用于抑制caveolin-1表達的RPMVECs后應(yīng)力纖維形成明顯減少,ERM磷酸化亦顯著降低。在caveolin-1表達正常的RPMVECs中抑制PKC的活化仍可見TNF-α所至的F-actin的聚集和應(yīng)力纖維的形成,但ERM磷酸化顯著降低(與control-sh RNA+TNF-α組相比)。7.成功構(gòu)建三個重組pLL3.7-moesin載體質(zhì)粒,并且包裝為相應(yīng)慢病毒,經(jīng)濃縮后滴度依次為109TU/ml、109TU/ml、3×109 TU/ml。三個靶位點對moesin表達抑制效率分別為61.5±11.2%、53.6±8.5%、76.1±3.8%。8.RPMVECs在正常情況下即有少量磷酸化ERM表達,TNF-α作用2小時后ERM磷酸化顯著增加,PKC抑制劑BIM可抑制TNF-α介導(dǎo)的ERM磷酸化。抑制caveolin-1的表達可顯著降低TNF-α介導(dǎo)的ERM磷酸化,同時BIM在caveolin-1低表達的RPMVECs中抑制TNF-α介導(dǎo)的ERM磷酸化作用不顯著。9.抑制moesin表達可減輕TNF-α介導(dǎo)的RPMVECs單層通透性增高。結(jié)論1.Caveolin-1可通過調(diào)節(jié)PKC活性減輕TNF-α致大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞單層通透性的增高。2.TNF-α致大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞骨架重組及ERM磷酸化增加部分依賴于caveolin-1的存在。3.成功構(gòu)建moesin低表達大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞模型。4.抑制moesin表達可減輕TNF-α致大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞單層通透性的增高。
【關(guān)鍵詞】：肺微血管內(nèi)皮細胞 小窩蛋白-1 埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白 通透性 細胞骨架 RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563.8
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 第一部分 Caveolin-1通過作用于PKC參與TNF-α致大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞單層通透性增高的調(diào)控機制17-41
• 1 引言17-18
• 2 材料與方法18-32
• 2.1 實驗材料18-20
• 2.1.1 實驗動物18
• 2.1.2 主要試劑及耗材18-20
• 2.2 實驗方法20-30
• 2.2.1 試劑配制20-24
• 2.2.2 RPMVECs分離培養(yǎng)24-25
• 2.2.2.1 原代RPMVECs細胞培養(yǎng)24-25
• 2.2.2.2 RPMVECs的消化傳代25
• 2.2.3 RPMVECs鑒定25-26
• 2.2.3.1 RPMVECs生長形態(tài)觀察25
• 2.2.3.2 CD34相關(guān)抗原鑒定25-26
• 2.2.3.3 植物凝血素結(jié)合實驗26
• 2.2.4 Western blot26-29
• 2.2.5 RPMVECs通透性檢測29-30
• 2.3 實驗方案30-31
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)處理31-32
• 3 結(jié)果32-38
• 4 討論38-41
• 第二部分 Caveolin-1對TNF-α誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞骨架蛋白及骨架結(jié)合蛋白形態(tài)學(xué)改變的影響41-53
• 1 引言41-42
• 2 材料與方法42-46
• 2.1 實驗材料42-43
• 2.2 實驗方法43-45
• 2.3 實驗分組45-46
• 3 結(jié)果46-50
• 4 討論50-53
• 第三部分 Caveolin-1及ERM在TNF-α致大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞單層通透性增高中的信號轉(zhuǎn)到機制53-71
• 1 引言53-54
• 2 材料與方法54-64
• 2.1 實驗材料54-56
• 2.2 實驗方法56-63
• 2.3 實驗分組63
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)處理63-64
• 3 結(jié)果64-69
• 4 討論69-71
• 全文結(jié)論71
• 參考文獻71-76
• 附錄76-78
• 致謝78-79
• 綜述79-84
• 參考文獻82-84

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