本文關(guān)鍵詞：溫莪術(shù)內(nèi)生真菌突變株代謝產(chǎn)物研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：植物內(nèi)生真菌是指寄居于健康植物組織或細胞內(nèi)而不引起宿主產(chǎn)生明顯病癥的一類微生物。其代謝產(chǎn)物種類豐富、生理活性多樣,是抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等天然活性物質(zhì)的重要來源。本文主要采用活性追蹤的方法,研究了藥用植物溫莪術(shù)內(nèi)生真菌突變株的次級代謝產(chǎn)物,旨在獲得天然活性物質(zhì),為制備植物藥用有效成分探索新途徑。內(nèi)容包括：溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的分離、鑒定及活性菌株的篩選；活性菌株EZG0807分子生物學(xué)鑒定及其生物學(xué)性質(zhì)研究；利用超導(dǎo)磁體模擬空間環(huán)境條件對菌株EZG0807進行誘變及其突變株的篩選；突變株M7226發(fā)酵條件優(yōu)化；菌株M7226次級代謝產(chǎn)物的分離、純化及其結(jié)構(gòu)表征；菌株M7226次級代謝產(chǎn)物生物活性研究。結(jié)果如下：(1)采用組織塊表面消毒法從溫莪術(shù)根、莖和葉中分離得到66株內(nèi)生真菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定,分別歸屬于5目、7科、14屬,其中優(yōu)勢屬為青霉屬(Penicillium)、鐮孢霉屬(Fusarium)和曲霉屬(Aspergillus);抗菌活性實驗結(jié)果顯示溫莪術(shù)根部內(nèi)生真菌EZG0807對四種指示細菌(Escherichia coli、Proteus vulgaris、Bacillus subtilis和Staphylococcus aureus)和四種指示真菌(Microzyme、Aspergillus niger、Rhizopus和Mucor)均具有較強的抑制作用；該菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和真菌ITS序列分析,鑒定為Gibberella moniliformis,命名為Gibberella moniliformis EZG0807,并將其ITS序列提交至GenBank,登錄號為JQ003920。(2)利用大梯度超導(dǎo)磁體模擬空間環(huán)境對G. moniliformis EZG0807進行誘變,并采用AFLP分子標記技術(shù)對其誘變機制進行探索,實驗結(jié)果表明：大梯度超導(dǎo)磁體模擬空間環(huán)境條件使出發(fā)菌株G moniliformis EZG0807DNA條帶發(fā)生缺失,導(dǎo)致基因突變。(3)采用稀釋涂布平板法對誘變后菌株G. moniliformis EZG0807分離和純化,得到139株突變菌株；經(jīng)濾紙片抑菌法初篩和MTT法抗腫瘤細胞活性實驗復(fù)篩,得到1株高活性且遺傳穩(wěn)定的突變菌株M7226。與出發(fā)菌株G. moniliformis EZG0807相比,M7226發(fā)酵液對四種指示細菌E. coli、P. vulgaris、B. subtilis和S. aureus的抑制能力均有所提高,對人非小細胞肺癌細胞A549、肺癌細胞H460、人乳腺癌細胞MCF-7和人肝癌細胞HepG2均有較強的抑制作用,統(tǒng)計學(xué)上均具有顯著性差異。(4)利用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計,優(yōu)化突變菌株M7226的發(fā)酵條件,得到最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度29℃,初始pH值6.8,發(fā)酵時間10 d。在此條件下,經(jīng)發(fā)酵放大和組合分離、純化方法,從其發(fā)酵液中獲得5個單體化合物。利用波譜技術(shù)并結(jié)合理化性質(zhì)確定5個化合物分別為姜黃素、肉桂酸、1,4-二羥基蒽醌、赤霉酸和山奈酚。(5)MIC法體外檢測5個化合物對四種指示菌(E. coli、P. vulgaris、B. subtilis和S. aureus)的抑制作用,結(jié)果顯示：①姜黃素和1,4-二羥基蒽醌對四種指示菌均有較強的抑制作用,且呈濃度依賴性,其中姜黃素對E. coli、P. vulgaris、B. subtilis和S. aureus的MIC值分別為200、200、200和50 μg/mL;1,4-二羥基蒽醌對E. coli、P. vulgaris、 B. subtilis和S. aureus的MIC值分別為200、400、400和200 μg/mL;②赤霉酸、山奈酚和肉桂酸對四種指示菌抑制作用不顯著,MIC值均大于400 μg/mL。(6) Alamar Blue法檢測5個化合物對人乳腺癌細胞MCF-7、人非小細胞肺癌細胞A549、肺癌細胞H460和人肝癌細胞HepG2細胞毒性,結(jié)果顯示：①姜黃素對HepG2、 H460、MCF-7和A549的增殖均具有較強的抑制作用,IC50值分別為14.12、24.65、20.25和16.42μg/mL;②山奈酚的抗腫瘤活性次之,對HepG2、H460、MCF-7和A549的IC50值分別為60.47、90.22、90.95和129.60③當赤霉酸濃度為200作用時間為24 h,對HepG2 μg/mL增殖的抑制率達24.8%；④當肉桂酸濃度為200 μg/mL作用時間為24 h,對A549的抑制率達13.1%；⑤1,4-二羥基蒽醌對四種腫瘤細胞的增殖均有一定的抑制作用,但作用效果相對較弱。(7)利用影像學(xué)技術(shù),通過Hoechst33258染色法、AO/EB雙熒光染色法及活體細胞在線培養(yǎng)觀察人肝癌細胞HepG2經(jīng)姜黃素作用后細胞形態(tài)的變化。Hoechst33258染色結(jié)果顯示：HepG2細胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀亮藍色熒光,細胞表現(xiàn)出核質(zhì)濃縮、核仁破裂等凋亡特征；AO/EB雙熒光試驗結(jié)果表明：HepG2細胞隨著藥物濃度的增加,細胞變得稀疏,染色質(zhì)濃縮,細胞核碎裂呈點狀,被染成大小不一、致密濃染的橘黃色顆粒；活體細胞在線培養(yǎng)觀察結(jié)果顯示：HepG2細胞皺縮、胞體變小、染色質(zhì)濃縮成碎片狀、質(zhì)膜下陷包裹核碎片和細胞器,出現(xiàn)凋亡小體；在此過程中未觀察到細胞膜的破裂、內(nèi)容物的釋放,表明姜黃素能夠促使HepG2細胞凋亡,而不是導(dǎo)致細胞壞死。上述形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果均表明,經(jīng)姜黃素作用后的HepG2細胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征。(8)RT-PCR試驗結(jié)果表明：經(jīng)姜黃素作用后的HepG2細胞,Bcl-2基因表達下調(diào)、Bax、Caspase 3和Caspase 8基因表達上調(diào),揭示姜黃素可能通過線粒體依賴性和非依賴性兩種途徑誘導(dǎo)人肝癌細胞HepG2凋亡。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)生真菌 溫莪術(shù) 超導(dǎo)磁體 誘變 次級代謝產(chǎn)物 結(jié)構(gòu)鑒定 細胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：南京理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R915
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 1 緒論14-33
• 1.1 植物內(nèi)生真菌14-16
• 1.2 內(nèi)生真菌宿主植物的選擇16-17
• 1.3 植物內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物研究進展17-27
• 1.3.1 生物堿類17-19
• 1.3.2 萜類19-20
• 1.3.3 甾體類20
• 1.3.4 醌類20-21
• 1.3.5 酯類21-23
• 1.3.6 黃酮類23-24
• 1.3.7 酚類及有機酸24
• 1.3.8 酮類24-26
• 1.3.9 其他類型26-27
• 1.4 植物內(nèi)生真菌產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物的機制27
• 1.5 微生物誘變27-31
• 1.5.1 物理誘變28
• 1.5.2 化學(xué)誘變28-29
• 1.5.3 復(fù)合誘變29
• 1.5.4 空間誘變及其地面模擬誘變29-31
• 1.6 研究目的和意義31-32
• 1.7 研究內(nèi)容32-33
• 2 溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的分離、鑒定及活性菌株的篩選33-41
• 2.1 實驗材料34-35
• 2.1.1 生物材料34
• 2.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基34
• 2.1.3 主要儀器34-35
• 2.2 實驗方法35-36
• 2.2.1 溫莪術(shù)內(nèi)生真菌分離鑒定35
• 2.2.2 活性菌株篩選35-36
• 2.3 結(jié)果與討論36-39
• 2.3.1 溫莪術(shù)內(nèi)生真菌分離鑒定36-38
• 2.3.2 活性菌株篩選38-39
• 2.4 小結(jié)39-41
• 3 活性菌株EZG0807分子生物學(xué)鑒定及其生物學(xué)特性研究41-53
• 3.1 實驗材料41-43
• 3.1.1 菌株41-42
• 3.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基42
• 3.1.3 主要儀器42-43
• 3.2 實驗方法43-45
• 3.2.1 活性菌株形態(tài)學(xué)特征43
• 3.2.2 活性菌株分子生物學(xué)鑒定43-44
• 3.2.3 活性菌株生物學(xué)特性44-45
• 3.3 結(jié)果與討論45-52
• 3.3.1 活性菌株EZG0807的鑒定45-48
• 3.3.2 活性菌株EZG0807生物學(xué)特性48-52
• 3.4 小結(jié)52-53
• 4 模擬空間環(huán)境誘變內(nèi)生真菌EZG080753-77
• 4.1 實驗材料54-55
• 4.1.1 微生物材料54
• 4.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基54-55
• 4.1.3 主要儀器55
• 4.2 實驗方法55-62
• 4.2.1 模擬空間環(huán)境誘變EZG080755-56
• 4.2.2 高活性突變株的篩選56-57
• 4.2.3 高活性突變株的遺傳穩(wěn)定性檢測57
• 4.2.4 高活性突變株與出發(fā)菌株的比較57-58
• 4.2.5 AFLP分子標記58-60
• 4.2.6 目的條帶的克隆60-62
• 4.3 結(jié)果與討論62-76
• 4.3.1 高活性突變株的篩選62-66
• 4.3.2 突變菌株M7226的遺傳穩(wěn)定性66-67
• 4.3.3 突變菌株M7226與出發(fā)菌株EZG0807生物學(xué)性質(zhì)比較67-71
• 4.3.4 模擬空間環(huán)境誘變機理探索71-76
• 4.4 小結(jié)76-77
• 5 菌株M7226發(fā)酵條件優(yōu)化77-87
• 5.1 實驗材料78
• 5.1.1 菌株78
• 5.1.2 主要培養(yǎng)基78
• 5.2 實驗方法78-79
• 5.2.1 RSM優(yōu)化發(fā)酵條件78
• 5.2.2 菌株發(fā)酵及樣品制備78
• 5.2.3 發(fā)酵液抑菌活性測定78-79
• 5.3 結(jié)果與討論79-85
• 5.3.1 實驗設(shè)計方案79
• 5.3.2 二次回歸擬合及方差分析79-81
• 5.3.3 最佳發(fā)酵條件的確定81-85
• 5.4 小結(jié)85-87
• 6 菌株M7226次級代謝產(chǎn)物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性研究87-103
• 6.1 實驗材料88-89
• 6.1.1 菌株88
• 6.1.2 主要試劑88-89
• 6.1.3 主要儀器89
• 6.2 實驗方法89-93
• 6.2.1 菌株M7226發(fā)酵及發(fā)酵液的預(yù)處理89-90
• 6.2.2 菌株M7226發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離90-91
• 6.2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定91-93
• 6.2.4 最小抑菌濃度測定93
• 6.2.5 細胞抑制率測定93
• 6.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析93
• 6.3 結(jié)果與討論93-101
• 6.3.1 菌株M7226次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定94-97
• 6.3.2 單體化合物抗菌活性分析97-99
• 6.3.3 單體化合物抗腫瘤活性分析99-101
• 6.4 小結(jié)101-103
• 7 次級代謝產(chǎn)物體外抗腫瘤作用機制探索103-115
• 7.1 實驗材料104-105
• 7.1.1 樣品104
• 7.1.2 細胞株104
• 7.1.3 培養(yǎng)基及試劑104
• 7.1.4 主要儀器104-105
• 7.2 實驗方法105-107
• 7.2.1 熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)105
• 7.2.2 活體細胞在線培養(yǎng)105
• 7.2.3 RT-PCR測定基因表達水平105-107
• 7.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析107
• 7.3 結(jié)果與討論107-114
• 7.3.1 熒光顯微鏡下HepG2細胞形態(tài)107-109
• 7.3.2 活體細胞在線培養(yǎng)109-110
• 7.3.3 HepG2細胞相關(guān)基因表達水平110-114
• 7.4 小結(jié)114-115
• 8 結(jié)論與展望115-118
• 8.1 結(jié)論115-117
• 8.2 創(chuàng)新點117
• 8.3 展望117-118
• 致謝118-119
• 參考文獻119-139
• 附錄139-140
• 攻讀博士學(xué)位期間所發(fā)表的論文139
• 攻讀博士學(xué)位期間參加與本學(xué)位相關(guān)的科研課題139-140
• 附圖140-144

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1 何穎;談鋒;謝建平;;紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇研究進展[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2006年03期

2 苗翠蘋;余瑩;陳有為;王皎;吳少華;;滇牡丹內(nèi)生真菌的分離及其抑菌活性研究[J];中國藥學(xué)雜志;2011年10期

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本文編號：314775