本文關(guān)鍵詞：PIK3R1基因在腎細(xì)胞癌中的功能及調(diào)控機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,近年來發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢,嚴(yán)重威脅人類生命健康。腎細(xì)胞癌常發(fā)病隱匿,約30%腎細(xì)胞癌在初次診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移。腎細(xì)胞癌對放化療不敏感,根治性手術(shù)切除是其唯一有效的治療方式,但是術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍較高。腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移(metastatic renal cell carcinoma, mRCC)預(yù)后不良,5年生存率10%。多項多中心的詢證醫(yī)學(xué)研究表明,分子靶向藥物可延長腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移患者的生存期,然而效果仍十分有限。腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移對腎細(xì)胞癌的治療構(gòu)成了極大的挑戰(zhàn)。腎細(xì)胞癌起源于腎小管上皮細(xì)胞,其中約75%為腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)。目前研究表明,VHL (von Hippel-Lindau tumor suppressor, VHL)、SETD2 (SET domain containing 2, SETD2)及PBRM1 (polybromo 1, PBRM1)等基因突變和表達(dá)異常與腎細(xì)胞癌相關(guān)。亦有研究發(fā)現(xiàn),泛素介導(dǎo)的蛋白降解通路(ubiquitin-mediated proteolysis pathway, UMPP)相關(guān)基因突變也是腎細(xì)胞癌的發(fā)病機制之一。與腎細(xì)胞癌相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)表明,目前對腎細(xì)胞癌的分子機制研究尚不完全。除UMPP信號通路外,磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)信號通路也被認(rèn)為是腎細(xì)胞癌的重要信號通路。PI3K是通過結(jié)合定位于質(zhì)膜的受體而激活,并通過磷酸化磷脂酰肌醇4,5二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2)產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate, PIP3)。AKT通過PH結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homology domain, PH)結(jié)合PIP3,從而形成磷酸化的AKT (phosphorylated AKT, pAKT),進(jìn)而啟動PI3K/AKT信號通路。I型P13K是PI3Ks家族中被最廣泛研究的分子,它由一個催化亞基和調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成,具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性。催化亞基p110a由PIK3CA基因編碼,而調(diào)節(jié)亞基p85a由PIK3R1基因編碼。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,是PI3K主要下游效應(yīng)分子之一,可通過直接磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)化和存活等多種生命活動過程。PI3K/AKT信號通路中的關(guān)鍵編碼基因如PIK3CA、AKT和PTEN等結(jié)構(gòu)改變使PI3K活化過程中通過正常酪氨酸激酶受體RTK (receptor tyrosine kinase)信號對p85/p110復(fù)合物的負(fù)調(diào)節(jié)作用被解除,從而導(dǎo)致PI3K的組成性活化和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。PI3K/AKT信號通路在人類腫瘤譜中廣泛失調(diào)。文獻(xiàn)報道,該信號通路改變在乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和尿路上皮癌等多種腫瘤發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。該信號通路成分異常引起的功能失調(diào)亦與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò)(The Cancer Genome Atlas Research Network, TCGA)對450例ccRCC和對應(yīng)的癌旁腎正常組織測序分析發(fā)現(xiàn),29%腎癌組織存在PI3K/AKT信號通路相關(guān)基因突變,并推測PI3K/AKT信號通路相關(guān)基因改變引起的信號通路異�？赡芘c腎細(xì)胞癌侵襲相關(guān)。PI3K/AKT信號通路在腎細(xì)胞癌發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用,因此該信號通路展現(xiàn)出作為腎細(xì)胞癌分子靶向治療的良好前景。目前開發(fā)的相關(guān)藥物主要包括PI3K、AKT和mTOR抑制劑。然而,僅有少數(shù)患者從該通路靶向藥物治療中獲益,所以還有待進(jìn)一步明確此類藥物治療腎細(xì)胞癌效果不佳的相關(guān)機制。除目前較為普遍研究的PIK3CA和PTEN分子外,該信號通路的其他分子是否也在腎細(xì)胞癌發(fā)病機制中發(fā)揮作用,并可成為有效治療靶點?越來越多的研究表明,PIK3R1基因在腫瘤生物分子機制中亦發(fā)揮重要作用。PIK3R1基因在卵巢癌和結(jié)腸癌中發(fā)揮癌基因作用,然而在肝細(xì)胞癌中卻發(fā)揮抑癌基因的作用。PIK3R1的錯義突變所致PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)也與結(jié)腸癌存在關(guān)聯(lián)性。有學(xué)者對一位腎細(xì)胞癌患者的原發(fā)病灶、腔靜脈癌栓、腦轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn),僅腦轉(zhuǎn)移灶存在PIK3R1基因無義突變。PIK3R1基因無義點突變可使P85亞單位多肽鏈翻譯中止,從而導(dǎo)致PIK3R1基因表達(dá)量降低。因此,我們推測PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)可能使腎癌細(xì)胞獲得易位、遠(yuǎn)處定植和生長的優(yōu)勢。綜上所述,腎細(xì)胞癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢,PI3K/AKT信號通路是腎細(xì)胞癌的重要信號通路,目前尚未有研究探討PIK3R1基因在腎細(xì)胞癌中的功能,所以我們認(rèn)為有必要明確PIK3R1基因在腎細(xì)胞癌中的作用。本研究首先通過免疫組織化學(xué)和實時熒光定量PCR (real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測分析PIK3R1基因在腎細(xì)胞癌組織(包括腎細(xì)胞癌原發(fā)病灶和腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移病灶)的表達(dá)情況,并且應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了PDGR1基因低表達(dá)細(xì)胞模型,隨后通過腫瘤集落形成、皮下成瘤、腫瘤細(xì)胞遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞成球等實驗,探討PDGR1基因在腎細(xì)胞癌中的功能及調(diào)控機制。本論文可分為以下六章。第一章PIK3R1基因在腎細(xì)胞癌組織的表達(dá)分析目的：探討PIK3R1基因在腎細(xì)胞癌和腎正常組織的表達(dá)情況。方法：收集2008年5月至2013年4月間在我院行腎癌根治性切除術(shù)的13例患者的石蠟包埋的癌旁腎正常組織、對應(yīng)的腎細(xì)胞癌原發(fā)病灶組織、腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移病灶組織,采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測組織中PIK3R1基因蛋白表達(dá)量。同時亦收集2009年5月至2013年9月間在我院行腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移病灶的活組織穿刺病理檢查,但未行腎癌根治性切除術(shù)的8例患者的轉(zhuǎn)移病灶組織的石蠟包埋組織,采用免疫組化技術(shù)檢測組織中PIK3R1基因蛋白表達(dá)量。我們也收集2012年8月至2013年10月間在我院行腎癌根治性切除術(shù)的18例患者的腎細(xì)胞癌原發(fā)病灶及對應(yīng)的癌旁腎正常組織,采用RT-PCR技術(shù)檢測組織中PIK3R1基因mRNA表達(dá)量。結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示,腎細(xì)胞癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶PDGR1蛋白表達(dá)量均顯著低于正常腎組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)量(P0.001,P0.001)；同時,腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移灶組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)量亦顯著低于腎細(xì)胞癌原發(fā)灶組織PDGR1蛋白表達(dá)量(P0.001)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,腎細(xì)胞癌原發(fā)病灶組織PIK3R1基因mRNA表達(dá)量顯著低于正常腎組織PIK3R1基因mRNA表達(dá)量(0.5286±0.4671 VS 2.4872±0.6466, t=0.417, P0.001)=T2和T3-4期腎細(xì)胞癌組織的PDGR1基因mRNA表達(dá)量均顯著低于T1期腎細(xì)胞癌組織的PDGR1基因mRNA表達(dá)量(P0.001,P=0.001)；同時T3-4腎細(xì)胞癌組織的PDGR1基因mRNA表達(dá)量亦顯著低于T2期腎細(xì)胞癌組織的PDGR1基因mRNA表達(dá)量(P=0.004)。線性分析表明,PDGR1基因表達(dá)量與NCAD基因表達(dá)量呈負(fù)性相關(guān)(Person r=-0.6929, P=0.0014; y=-1.0978x+2.8781, R2=0.4801)。結(jié)論：PDGR1基因表達(dá)量在腎正常組織中最高,而在腎細(xì)胞癌原發(fā)灶組織和轉(zhuǎn)移灶組織中依次降低。PDGR1基因表達(dá)量與腫瘤分期相關(guān),晚期腫瘤組織的表達(dá)量低于早期腫瘤組織的表達(dá)量。PDGR1基因表達(dá)量與NCAD基因表達(dá)量呈負(fù)性相關(guān)。PDGR1基因在腎細(xì)胞癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用,該基因表達(dá)下調(diào)可能與腎細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān),但仍需細(xì)胞功能研究來進(jìn)一步明確其在腎細(xì)胞癌中的作用。第二章PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖目的：通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建PDGR1基因低表細(xì)胞模型,并在細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上研究PDGR1基因表達(dá)下調(diào)對腎細(xì)胞癌增殖和腫瘤形成的影響。方法：首先,采用RT-PCR分析正常腎小管上皮細(xì)胞株(HK2)和腎癌細(xì)胞系(786-0, A-498, A-704和ACHN)的PDGR1基因表達(dá)水平。其次,通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲減野生型腎癌細(xì)胞(786-O和A-704)的PDGR1基因、G418藥物篩選細(xì)胞單克隆,構(gòu)建PDC3R1基因低表達(dá)細(xì)胞模型。隨后,采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測野生型腎癌細(xì)胞和構(gòu)建的細(xì)胞模型(786-mut1、 786-mut2、A-704-mut1和A-704-mut2)的PIK3R1基因的表達(dá)情況。最后,應(yīng)用野生型和細(xì)胞模型進(jìn)行細(xì)胞平板克隆形成和皮下成瘤實驗,評估PIK3R1基因?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖和腫瘤形成能力的作用。結(jié)果：786-0和A-704細(xì)胞PIK3R1基因表達(dá)量均顯著高于HK2細(xì)胞PIK3R1基因表達(dá)量(P=0.021,P=0.038)。786-0和A-704腎癌細(xì)胞PIK3R1基因在chr5：67576819位點附近堿基未發(fā)生基因突變。因此,選擇786-0和A-704細(xì)胞系來構(gòu)建PIK3R1基因低表達(dá)模型。采用CRISPR/Cas9技術(shù)、G418藥物篩選和Sanger測序驗證后,獲得發(fā)生PIK3R1基因單倍體缺失突變的786-mut1、786-mut2、 A-704-mut1和A-704-mut2細(xì)胞。與野生型細(xì)胞相比,786-mut1和786-mut2細(xì)胞的PIK3R1基因的mRNA表達(dá)量均顯著下降(P0.001,P0.001)。786-mut1和786-mut2細(xì)胞的PIK3R1基因蛋白表達(dá)量也降低。與野生型細(xì)胞相比,A-704-mutl和A-704-mut2細(xì)胞的PIK3R1基因mRNA的表達(dá)量亦均顯著下降(P0.001,P0.001)。A-704-mut1和A-704-mut2細(xì)胞的PIK3R1基因蛋白表達(dá)量也降低。與野生型細(xì)胞相比,786-mutl和786-mut2細(xì)胞的平板克隆數(shù)均顯著性增加(P0.001,P=0.002); A-704-mut1和A-704-mut2細(xì)胞的平板克隆量亦均顯著增加(P0.001,P=0.001)。786-mut1和786-mut2細(xì)胞腫瘤體積均顯著大于野生型786-0細(xì)胞形成的腫瘤體積(P=0.004,P=0.006)。A-704-mut1和A-704-mut2細(xì)胞的腫瘤體積亦均顯著大于野生型A-704細(xì)胞形成的腫瘤體積(P=0.006,P=0.009)。結(jié)論：CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的細(xì)胞模型(786-mut1、786-mut2、A-704-mut1和A-704-mut2)的PIK3R1基因較野生型細(xì)胞的表達(dá)明顯下降,表明已成功構(gòu)建PIK3R1基因低表達(dá)細(xì)胞模型。平板克隆形成實驗和皮下成瘤實驗表明,PIK3R1基因低表達(dá)細(xì)胞的增殖能力和成瘤能力強于野生型細(xì)胞,進(jìn)一步提示PIK3R1基因在腎癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用。第三章PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化目的：明確PK3R1基因表達(dá)下調(diào)對腎癌細(xì)胞遷移能力和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影響。方法：在前期構(gòu)建的PIK3R1基因低表細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,應(yīng)用野生型和PIK3R1基因低表細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞劃痕和transwell小室實驗。同時,應(yīng)用RT-PCR和WB技術(shù)檢測細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的mRNA和蛋白的表達(dá)量。結(jié)果：劃痕18小時后,786-mut1和786-mut2細(xì)胞的遷移面積明顯大于786-O細(xì)胞的遷移面積。A-704-mut1和A-704-mut2細(xì)胞的遷移面積亦明顯大于A-704細(xì)胞的遷移面積。穿過Transwell小室膜的786-mut1和786-mut2細(xì)胞明顯多于786-O細(xì)胞。穿過Transwell小室的A-704-mutl和A-704-mut2細(xì)胞亦明顯多于A-704細(xì)胞。PIK3R1低表達(dá)腎癌細(xì)胞(786-mut1、786-mut2、A-704-mutl和A-704-mut2)表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征。與野生型786-O細(xì)胞相比,786-mut1和786-mut2細(xì)胞的ECAD基因表達(dá)量均顯著下降(P=0.034, P=0.041); NCAD、VIM和ZEB1基因表達(dá)量均顯著升高(P=0.010, P=0.022)、(P=0.021,P=0.037)、(P=0.043,P=0.018)。然而,與野生型786-O細(xì)胞相比,786-mut1和786-mut2細(xì)胞的CD44基因表達(dá)量雖然均增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.224,P=0.067)。786-O與786-mut1和786-mut2細(xì)胞組間POU5F1基因表達(dá)量無顯著性差異(F=3.971,P=0.080)。與野生型A-704細(xì)胞相比,A-704-mut1和A-704-mut2細(xì)胞的ECAD基因表達(dá)量均顯著下降(P=0.035, P=0.033); NCAD、VIM、ZEB1基因基因表達(dá)量均顯著升高(P=0.014,P=0.043)、(P=0.012, P=0.010)、(P=0.015, P=0.013)。然而,與野生型A-704細(xì)胞相比,A-704-mut1和A-704-mut2細(xì)胞的CD44基因表達(dá)量雖然均增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.082,P=0.051)。A-704與A-704-mut1和A-704-mut2細(xì)胞組間POU5F1基因表達(dá)量均數(shù)無顯著性差異(F=2.803,P=0.138)。結(jié)論：PIK3R1基因低表達(dá)可引起EMT相關(guān)基因表達(dá)變化,導(dǎo)致腎癌細(xì)胞發(fā)生EMT,進(jìn)而促進(jìn)腎癌細(xì)胞的遷移。PK3R1基因表達(dá)下調(diào)可能與腎細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。第四章PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞的干性目的：分析野生型細(xì)胞和PIK3R1基因低表達(dá)細(xì)胞的腎癌細(xì)胞干性表型。方法：首先,通過體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)野生型細(xì)胞和PIK3R1基因低表細(xì)胞,觀察兩種細(xì)胞的干細(xì)胞球形成情況。其次,分別使用抗CD44、CD133和CXCR4抗體標(biāo)記野生型細(xì)胞和PIK3R1低表達(dá)細(xì)胞模型,隨后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞亞群。最后,采用RT-PCR檢測野生型細(xì)胞和PIK3R1基因低表達(dá)細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果：無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后,與野生型786-0細(xì)胞相比,786-mut1和786-mut2細(xì)胞形成的干細(xì)胞球數(shù)均顯著增加(P0.001,P0.001)。與野生型A-704細(xì)胞相比,A-704-mut1和A-704-mut2細(xì)胞形成的干細(xì)胞球數(shù)亦均顯著增多(P0.001,P0.001)。與野生型786-0細(xì)胞相比,786-mutl和786-mut2細(xì)胞中CD44、CD 133和CXCR4陽性細(xì)胞亞群均顯著增多(P0.001,P0.001)、(P0.001,P0.001)、(P=0.005P=0.006)。與野生型A-704細(xì)胞相比,A-704-mutl和A-704-mut2細(xì)胞中CD44、CD133、CXCR4陽性細(xì)胞亞群均顯著增多(P0.001,P0.001)、(P0.001,P0.001)、(P0.001, P0.001)。PIK3R1低表細(xì)胞中CD44、CD133和CXCR4陽性細(xì)胞亞群比例高于野生型細(xì)胞中的該類型細(xì)胞亞群比例。與786-0細(xì)胞相比,786-mmutl和786-mut2細(xì)胞中CTNNB1基因表達(dá)量顯著增高(P0.001,P0.001)。整體而言,786-0、786-mut1和786-mut2細(xì)胞組間HES1、GLI1和NANOG基因表達(dá)量均數(shù)無有顯著差異(F=4.400,P=0.067)(F=2.350,P=0.176)、(F=1.339,P=0.330)。與A-704細(xì)胞相比,A-704-mutl和A-704-mut2細(xì)胞中CTNNB1基因表達(dá)量也顯著升高(P=0.019,P=0.033); HES1基因表達(dá)量下降,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.075、P=0.061)。整體而言,A-704、A-704-mut1和A-704-mut2細(xì)胞間GL11基因表達(dá)量均數(shù)無顯著差異(F=5.205,P=0.096)。與野生型A-704細(xì)胞相比,A-704-mutl和A-704-mut2細(xì)胞NANOG基因表達(dá)量均顯著下降(P0.001,P0.001)�？傊�,與野生型細(xì)胞相比,在PIK3R1基因低表細(xì)胞中CTNNB1基因表達(dá)量均升高。結(jié)論：PIK3R1基因低表達(dá)可促進(jìn)腎癌細(xì)胞的干性表型。CTNNB1基因可能在PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞干性表型過程中發(fā)揮重要作用。然而,PIK3R1基因低表達(dá)促進(jìn)腎癌細(xì)胞干性表型的分子機制還有待于進(jìn)一步研究。第五章PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)通過AKT磷酸化激活WNT/β-catenin信號通路目的：分析PIK3R1基因低表細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路及其相關(guān)通路的激活情況,以期明確PIK3R1基因調(diào)控腎癌細(xì)胞功能的分子機制。方法：首先,采用免疫共沉淀和WB技術(shù)分析野生型和PIK3R1基因低表達(dá)細(xì)胞中PIK3R1蛋白和P110蛋白的結(jié)合水平。其次,采用WB技術(shù)檢測AKT、磷酸化AKT、ERK、磷酸化ERK、GSK3β、磷酸化GSK3p和CTNNB1蛋白表達(dá)水平。最后,亦通過慢病毒敲減PIK3R1低表達(dá)細(xì)胞(786-mut1和A-704-mut2)的AKT基因,通過WB技術(shù)檢測磷酸化AKT、GSK3β、磷酸化GSK3β和CTNNB1蛋白。結(jié)果：與野生型細(xì)胞相比,PIK3R1基因低表細(xì)胞(786-mut1、786-mut2、 A-704-mut1和A-704-mut2)中與PIK3R1蛋白結(jié)合的p110α蛋白量降低,同時磷酸化AKT的表達(dá)量增加。我們亦發(fā)現(xiàn)PIK3R1基因低表細(xì)胞的CTNNB1蛋白和磷酸化GSK3β蛋白表達(dá)量升高。慢病毒敲減786-mutl和A-704-mut2細(xì)胞的AKT基因后我們發(fā)現(xiàn),與未行AKT基因敲減的細(xì)胞相比,AKT基因敲減細(xì)胞的pAKT、p-GSK3β和CTNNB1的表達(dá)量均下降。結(jié)論：PIK3R1基因低表細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路激活,并可通過AKT分子活化引起GSK3β磷酸化水平升高,導(dǎo)致CTNNB1表達(dá)量升高,進(jìn)而導(dǎo)致WNT/CTNNB1信號通路激活。CTNNB1基因可能在PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞干性表型中發(fā)揮重要作用,故有必要進(jìn)一步明確該基因在此過程中的調(diào)控作用。第六章PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)激活WNT/β-catenin信號通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞干性目的：探討CTNNB1基因在PDGR1基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞干性表型中發(fā)揮的作用。方法：首先,通過慢病毒敲減PIK3R1基因低表細(xì)胞的CTNNB1基因,在PI3R1基因低表細(xì)胞的基礎(chǔ)上構(gòu)建CTNNB1基因低表達(dá)細(xì)胞(786-mutlshCTNNB1和A-704-mut2 shCTNNB1細(xì)胞),并通過RT-PCR和WB技術(shù)分別檢測細(xì)胞中CTNNB1基因mRNA和蛋白表達(dá)量。其次,通過體外無血清腫瘤干細(xì)胞球培養(yǎng)786-mut1 shCtrl、A-704-mut2 shCtrl、786-mut1 shCTNNB1和 A-704-mut2 shCTNNB1細(xì)胞。同時,通過抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞儀分析786-mutlshCtrl、A-704-mut2 shCtr1、786-mut1 shCTNNB1和A-704-mut2 shCTNNB1細(xì)胞中CD44、CD133和CXCR4細(xì)胞亞群情況。最后,通過免疫缺陷小鼠的皮下成瘤實驗,分析786-mut1 shCTNNB1、A-704-mut2 shCTNNB1、786-mut1 shCtr1和A-704-mut2 shCtr1細(xì)胞的成瘤能力。結(jié)果：與786-mut1 shCtr1細(xì)胞相比,786-mut1 shCTNNB1細(xì)胞的CTNNB1基因mRNA表達(dá)量顯著降低(0.0722±0.0233 VS 1.0035±0.0605,t=24.892,P0.001)。與A-704-mut2 shCtr1細(xì)胞相比,A-704-mut2 shCTNNB1細(xì)胞的CTNNB1基因mRNA表達(dá)量亦顯著降低(0.0996±0.0325 VS 1.005267±0.0935, t=15.847, P0.001)。786-mut1 shCTNNB1和A-704-mut2 shCTNNB1細(xì)胞中CTNNB1基因的蛋白表達(dá)量亦明顯下降。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后,我們發(fā)現(xiàn),與786-mut1 shCtr1細(xì)胞相比,786-mut1 shCTNNB1細(xì)胞形成的干細(xì)胞球數(shù)顯著降低(8.00±2.4495 VS70.00±3.4278,t=44.148,P0.001)。與A-704-mut2 shCtr1細(xì)胞相比,A-704-mut2 sh CTNNB1細(xì)胞的干細(xì)胞球數(shù)亦顯著降低(11.3333±2.1213 VS 54.00士5.2202,t=22.716,P0.001)。流式細(xì)胞儀分析提示,與786-mut1 shCtr1細(xì)胞相比,786-mut1 shCTNNB1細(xì)胞中CD44、CD133和CXCR4陽性細(xì)胞亞群亦顯著降低(P0.001,P0.001,P0.001)。與A-704-mut2 shCtrl細(xì)胞相比,A-704-mut2 shCTNNB1細(xì)胞中CD44、CD133和CXCR4陽性細(xì)胞亞群顯著降低(P0.001,P0.001,P0.001)。皮下注射細(xì)胞30天后,786-mut1 shCTNNB1細(xì)胞形成的腫瘤體積顯著小于786-mut1 shCtr1細(xì)胞形成的腫瘤體積(253.13±79.5903 VS 923.4867±98.1402, t=9.189, P=0.001)。A-704-mut2 shCTNNB1細(xì)胞形成的腫瘤體積顯著小于A-704-mut2 shCtrl細(xì)胞形成的腫瘤體積(308.3033±75.4051 VS 75.4051±134.6369,t=9.149, P=0.001)。結(jié)論：PI3K/AKT信號通路和WNT/CTNNB1信號通路相互交叉,形成PI3K/AKT/GSK3P/CTNNB1信號通路。CTNNB1基因在PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞干性表型中發(fā)揮的重要作用。PIK3R1基因低表達(dá)通過激活PI3K/AKT/CTNNB1信號通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞的自我更新和腫瘤形成。
【關(guān)鍵詞】：PIK3R1基因 表達(dá)下調(diào) 腫瘤遷移 腫瘤干細(xì)胞 腎細(xì)胞癌
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-23
• 前言23-27
• 第一章 PIK3R1基因在腎細(xì)胞癌組織的表達(dá)分析27-38
• 引言27
• 材料和方法27-33
• 結(jié)果33-36
• 討論36-38
• 第二章 PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖38-55
• 引言38
• 材料和方法38-47
• 結(jié)果47-53
• 討論53-55
• 第三章 PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化55-68
• 引言55
• 材料和方法55-60
• 結(jié)果60-65
• 討論65-68
• 第四章 PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞的干性68-79
• 引言68
• 材料和方法68-72
• 結(jié)果72-77
• 討論77-79
• 第五章 PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)通過AKT磷酸化激活WNT/β-catenin信號通路79-88
• 引言79
• 材料和方法79-82
• 結(jié)果82-85
• 討論85-88
• 第六章 PIK3R1基因表達(dá)下調(diào)激活WNT/β-catenin信號通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞干性88-98
• 引言88
• 材料和方法88-92
• 結(jié)果92-96
• 討論96-98
• 全文總結(jié)98-100
• 綜述100-106
• 參考文獻(xiàn)106-115
• 博士學(xué)習(xí)期間發(fā)表論文115-116
• 縮略詞表116-117
• 致謝117-120
• 統(tǒng)計學(xué)證明120

  本文關(guān)鍵詞：PIK3R1基因在腎細(xì)胞癌中的功能及調(diào)控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：314736