本文關(guān)鍵詞：老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)特性及抗人肝癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：老鷹茶,又名豹皮樟,俗稱“白茶”,是具有安徽地域特色的中藥資源,主要分布于安徽省皖南山區(qū)。民間飲用表明老鷹茶具有解毒消腫、明目益思、生津止渴、解表防暑等功效。前期的研究表明,老鷹茶總黃酮TFLC為其活性部位,主要成分為槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-a-L-鼠李糖苷這五種黃酮苷類,其在降血糖、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面均具有顯著預(yù)防和治療作用。黃酮苷元槲皮素和山奈酚藥理作用與老鷹茶總黃酮的藥理作用相似,也具有抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用。雖然這些黃酮類化合物的很多藥理活性被研究報(bào)道,但是關(guān)于它們的吸收特點(diǎn)和機(jī)理尚不明確。口服給藥是常用的給藥方式。腸道吸收作為口服藥物進(jìn)入人體的第一步,決定了藥物的生物利用度和代謝動(dòng)力學(xué)行為。構(gòu)建一種細(xì)胞體外吸收模型來(lái)模擬人體小腸上皮的功能,對(duì)闡明藥物在腸道的吸收特性,明確影響藥物吸收和生物利用度的潛在因素至關(guān)重要。ABC(ATP-binding cassette,ATP結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類具有ATP結(jié)合區(qū)域單向底物外排泵,主要參與細(xì)胞內(nèi)藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和外排等過(guò)程,以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式完成多種分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。目前已有研究證實(shí),ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)與腫瘤細(xì)胞化療中產(chǎn)生的多藥耐藥性(mulitidrug resistance,MDR)密切相關(guān),但具體機(jī)制不詳。因此本課題以caco-2、mdck及人肝癌耐藥細(xì)胞株為研究對(duì)象,從以下三個(gè)方面開展實(shí)驗(yàn),研究老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類及其相對(duì)應(yīng)的黃酮苷元的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性,同時(shí)探討這些成分與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的相互作用及機(jī)制。一、老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元在caco-2/mdck細(xì)胞上的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)利用caco-2和mdck兩種細(xì)胞模型模擬人體小腸上皮,在細(xì)胞水平上研究老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類及其苷元的吸收特性、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理以及相互作用。在實(shí)驗(yàn)考察的轉(zhuǎn)運(yùn)濃度范圍內(nèi)(40、80、160μm),山奈酚-3-o-a-l-鼠李糖苷的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)可能以被動(dòng)擴(kuò)散為主,而槲皮素-3-o-β-d-半乳糖苷、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷、山奈酚-3-o-β-d-半乳糖苷、山奈酚-3-o-β-d-葡萄糖苷、槲皮素和山奈酚在雙向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中都具有濃度依賴性、ph值依賴性和能量依賴性,提示它們的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程可能既有被動(dòng)擴(kuò)散,又有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。槲皮素和山奈酚具有明顯的外排現(xiàn)象,外排率er遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2。主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sglt1)的抑制劑根皮苷對(duì)槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷和山奈酚-3-o-β-d-葡萄糖苷的吸收有一定的促進(jìn)作用,易化擴(kuò)散蛋白(glut2)抑制劑根皮素對(duì)槲皮素-3-o-β-d-半乳糖苷、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷、山奈酚-3-o-β-d-半乳糖苷和山奈酚-3-o-β-d-葡萄糖苷的吸收均有一定的促進(jìn)作用。p-糖蛋白(p-gp)抑制劑維拉帕米對(duì)于黃酮苷類的外排沒(méi)有明顯的作用,但是對(duì)其苷元槲皮素和山奈酚的外排有抑制作用;而多藥耐藥相關(guān)蛋白2(mrp2)抑制劑mk571和丙磺舒對(duì)于黃酮苷類和苷元的外排均有不同程度的抑制。當(dāng)這些成分兩兩相互作用后,苷元槲皮素和山奈酚可以促進(jìn)部分黃酮苷類的吸收,苷元槲皮素和山奈酚之間可以相互促進(jìn),但是黃酮苷類之間卻沒(méi)有明顯的促進(jìn)或抑制作用。二、老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元對(duì)caco-2細(xì)胞和人肝癌耐藥bel-7402/5-fu細(xì)胞中abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用由于abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在藥物吸收動(dòng)力學(xué)中發(fā)揮著很重要的作用,因此實(shí)驗(yàn)考察了黃酮苷類及其苷元對(duì)caco-2細(xì)胞和人肝癌耐藥bel/5-fu細(xì)胞中abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(mdr1/p-gp、mrp2)表達(dá)和功能活性的影響。在caco-2細(xì)胞單層中,黃酮苷元槲皮素(40、80、160μm)和山奈酚(80、160μm)可以明顯降低轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物的外排率,但是黃酮苷類對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能沒(méi)有明顯的作用。bel/5-fu細(xì)胞經(jīng)過(guò)苷元槲皮素(40、80、160μm)預(yù)處理后,能夠明顯下調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物的熒光強(qiáng)度,作用類似于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑。同時(shí),bel/5-fu細(xì)胞經(jīng)過(guò)槲皮素(40、80、160μm)預(yù)處理后,能夠明顯降低5-fu的ic50值,增加細(xì)胞敏感性,逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞耐藥性。三、黃酮苷元槲皮素通過(guò)抑制fzd7/β-catenin通路下調(diào)人肝癌耐藥細(xì)胞bel-7402/5-fu中abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥近年來(lái),abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥在肝癌耐藥中占有很大的比例,因此對(duì)abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行干預(yù)成為逆轉(zhuǎn)肝癌化療耐藥的重要途徑。越來(lái)越多的研究表明wnt/β-catenin信號(hào)通路與abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間有密切的聯(lián)系。文獻(xiàn)報(bào)道wnt蛋白的受體frizzled(fzd)7在肝癌耐藥細(xì)胞株中過(guò)表達(dá),作為wnt/β-catenin通路必不可少的組成元件,fzd7表達(dá)的改變可影響信號(hào)通路的調(diào)控進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。前期研究發(fā)現(xiàn)黃酮苷元槲皮素可以濃度依賴性地抑制abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和功能。為了考察黃酮苷元槲皮素對(duì)abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控機(jī)制,進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)bel-7402和bel/5-fu細(xì)胞中fzd7、mdr1/p-gp和mrp2均異常表達(dá),而在bel/5-fu耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)均明顯高于其親本細(xì)胞株bel-7402。轉(zhuǎn)染fzd7sirna(sifzd7)有效沉默fzd7后,細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin、細(xì)胞核內(nèi)β-catenin、mdr1/p-gp、mrp2的mrna和蛋白水平均明顯下降,5-fu、mmc和adr的ic50值明顯下降,bel/5-fu細(xì)胞內(nèi)rh123和adr的蓄積量增加;轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒gv144-fzd7后與sifzd7的結(jié)果相反。β-catenin的抑制劑icrt-3也能明顯抑制下游mdr1/p-gp和mrp2的mrna和蛋白表達(dá)水平。當(dāng)用不同濃度的槲皮素(40、80、160μm)處理耐藥細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)其能夠明顯抑制fzd7、細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin、細(xì)胞核內(nèi)β-catenin、mdr1/p-gp、mrp2的mrna和蛋白表達(dá),具有濃度依賴性。同時(shí),與槲皮素加sifzd7的陰性對(duì)照組sncrna(q+sncrna)相比,槲皮素加sifzd7共同處理組(q+sifzd7)可使得fzd7、細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin、細(xì)胞核內(nèi)β-catenin、mdr1/p-gp、mrp2mrna和蛋白表達(dá)水平明顯增加。提示槲皮素調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MDR1/P-gp、MRP2)的表達(dá)可能與抑制FZD7/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。綜上可知,老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類及其苷元的吸收可能與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MDR1/P-gp、MRP2)密切相關(guān),其中苷元槲皮素可能是通過(guò)FZD7/β-catenin信號(hào)通路從而調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MDR1/P-gp、MRP2)的表達(dá)和功能。
【關(guān)鍵詞】：黃酮類化合物 吸收 外排 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 多藥耐藥
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285
【目錄】：

• 中英文縮寫詞對(duì)照8-11
• 中文摘要11-15
• 英文摘要15-19
• 第一部分 老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元在Caco-2/MDCK細(xì)胞上的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)19-63
• 1. 前言19-22
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料22-25
• 2.1 藥品與試劑22-24
• 2.2 儀器和設(shè)備24-25
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法25-38
• 3.1 細(xì)胞單層模型的建立25-26
• 3.2 細(xì)胞單層模型的驗(yàn)證26-27
• 3.3 培養(yǎng)液中待測(cè)物的測(cè)定方法27-28
• 3.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性28-29
• 3.5 TFLC中主要黃酮苷類及其苷元的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)29
• 3.6 轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)pH值對(duì)主要黃酮苷類及其苷元轉(zhuǎn)運(yùn)的影響29
• 3.7 TFLC中主要黃酮苷類及其苷元轉(zhuǎn)運(yùn)的能量依賴性試驗(yàn)29
• 3.8 Real-time qPCR檢測(cè)Caco-2、MDCK細(xì)胞中MDR1，MRP2，SGLT1和GLUT2 mRNA的表達(dá)29-32
• 3.9 Western Blot法檢測(cè)Caco-2、MDCK細(xì)胞中P-gp，MRP2，SGLT1和GLUT2蛋白表達(dá)32-37
• 3.10 TFLC中主要黃酮苷類及其苷元介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)37
• 3.11 TFLC中主要黃酮苷類及其苷元在MDCK細(xì)胞模型上雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的相互作用37-38
• 3.12 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及參數(shù)計(jì)算38
• 3.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-58
• 4.1 細(xì)胞單層模型的建立和驗(yàn)證38-41
• 4.2 培養(yǎng)液中待測(cè)物的測(cè)定方法的評(píng)價(jià)41-44
• 4.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性44-45
• 4.4 TFLC中主要黃酮苷類及其苷元在Caco-2、MDCK細(xì)胞中的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)45-50
• 4.5 轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)pH值對(duì)主要黃酮苷類及其苷元轉(zhuǎn)運(yùn)的影響50-51
• 4.6 溫度以及ATP酶抑制劑對(duì)主要黃酮苷類及其苷元轉(zhuǎn)運(yùn)的影響51-52
• 4.7 Caco-2 和MDCK細(xì)胞中MDR1，MRP2，SGLT1和GLUT2 mRNA和蛋白表達(dá)52-55
• 4.8 不同抑制劑對(duì)主要黃酮苷類及其苷元的影響55-58
• 4.9 TFLC中主要黃酮苷類及其苷元雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的相互作用58
• 5. 討論58-63
• 第二部分 老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元對(duì)Caco-2細(xì)胞和人肝癌耐藥BEL-7402/5-FU細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用63-77
• 1. 前言63-65
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料65
• 2.1 藥品與試劑65
• 2.2 儀器和設(shè)備65
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法65-68
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)65
• 3.2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物在Caco-2 細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)65-66
• 3.3 Real-time qPCR檢測(cè)BEL-7402和BEL/5-FU細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)66
• 3.4 熒光顯微鏡觀察黃酮苷元槲皮素對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞內(nèi)Rh123和ADR蓄積的影響66-67
• 3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃酮苷元槲皮素對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞內(nèi)Rh123和ADR蓄積的影響67
• 3.6 MTT法檢測(cè)黃酮苷元槲皮素對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞耐藥性的影響67-68
• 3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析68
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果68-75
• 4.1 TFLC中主要黃酮苷類及其苷元對(duì)Caco-2 細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的影響68-69
• 4.2 槲皮素對(duì)BEL-7402、BEL/5-FU細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MDR1、MRP2 mRNA表達(dá)水平的影響69-71
• 4.3 槲皮素對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞內(nèi)Rh123和ADR蓄積的影響71-74
• 4.4 槲皮素對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞耐藥性的影響74-75
• 5. 討論75-77
• 第三部分 黃酮苷元槲皮素通過(guò)抑制FZD7/β-catenin通路下調(diào)人肝癌耐藥細(xì)胞BEL-7402/5-FU中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥77-102
• 1. 前言77-78
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料78-79
• 2.1. 藥品與試劑78
• 2.2 儀器和設(shè)備78-79
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法79-83
• 3.1 BEL-7402和BEL/5-FU細(xì)胞的培養(yǎng)79
• 3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染79
• 3.3 Real-time qPCR檢測(cè)BEL-7402和BEL/5-FU細(xì)胞中FZD7、β-catenin、MDR1和MRP2 mRNA的表達(dá)79-81
• 3.4 Western Blot法檢測(cè)BEL-7402和BEL/5-FU細(xì)胞中FZD7、β-catenin、P-gp和MRP2蛋白的表達(dá)81-82
• 3.5 MTT法測(cè)定FZD7對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞耐藥性的影響82
• 3.6 MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性82-83
• 3.7 熒光顯微鏡觀察FZD7對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞內(nèi)Rh123和ADR蓄積的影響83
• 3.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)FZD7對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞內(nèi)Rh123和ADR蓄積的影響83
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果83-100
• 4.1 BEL-7402和BEL/5-FU細(xì)胞中FZD7、MDR1/P-gp和MRP2的異常表達(dá)83-85
• 4.2 FZD7/β-catenin對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響85-91
• 4.3 FZD7對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞耐藥性的影響91-94
• 4.4 槲皮素對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用以及無(wú)毒劑量的篩選94-95
• 4.5 槲皮素對(duì)BEL/5-FU細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響95-96
• 4.6 槲皮素通過(guò)抑制FZD7/β-catenin信號(hào)通路從而抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)96-100
• 5. 討論100-102
• 結(jié)論102-104
• 參考文獻(xiàn)104-115
• 附錄115-118
• 致謝118-119
• 綜述119-151
• References137-151

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張悅,楊曉達(dá),王夔;2,6-吡啶二羧酸釩(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ)配合物透過(guò)MDCK細(xì)胞單層的能力以及與Caco-2細(xì)胞單層的比較[J];科學(xué)通報(bào);2005年14期

  本文關(guān)鍵詞：老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)特性及抗人肝癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：314516