[背景和目的]腸屏障損傷在許多疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用,其導(dǎo)致的微生物移位可引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),甚至導(dǎo)致死亡,尤其是在艾滋病（Acquired immune deficiency syndrome,AIDS）的進(jìn)程中。艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）感染人體后首先攻擊胃腸道,引起腸屏障損傷,進(jìn)而導(dǎo)致微生物移位,微生物移位引起的免疫活化是增加非艾滋病相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率,降低慢性感染期患者生活質(zhì)量的主要原因,更是推動(dòng)AIDS疾病進(jìn)程加速患者死亡的重要因素。因此,開(kāi)展腸道屏障損傷的分子機(jī)制研究,尋找腸屏障損傷修復(fù)的治療靶點(diǎn),對(duì)于提高患者生活質(zhì)量,延緩疾病進(jìn)程,延長(zhǎng)患者生命,意義深遠(yuǎn)。谷氨酰胺（Glutamine,Gln）作為重要的免疫營(yíng)養(yǎng)素,對(duì)腸黏膜屏障功能的維護(hù)至關(guān)重要,當(dāng)谷氨酰胺缺乏時(shí),會(huì)出現(xiàn)腸屏障功能?chē)?yán)重受損,但是人們對(duì)受損腸粘膜的異常谷氨酰胺代謝知之甚少,丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-2（Alanine,serine,cysteine-preferring transporter 2,ASCT2）是機(jī)體最重要的 Gln 轉(zhuǎn)運(yùn)載體... 

【文章來(lái)源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁(yè)數(shù)】：111 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖２．載體構(gòu)建過(guò)程中的電泳驗(yàn)證

結(jié)果??１．腸黏膜上皮細(xì)胞ＣＣＣ－ＨＩＥ－２培養(yǎng)形態(tài)??細(xì)胞傳代要注意匯合度，當(dāng)匯合度小于５０％時(shí)進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)??緩，不容易貼壁；但細(xì)胞傳代時(shí)匯合度不能過(guò)大，當(dāng)大于８０％時(shí)，傳代后細(xì)胞死??細(xì)胞過(guò)多，最終確定最佳細(xì)胞傳代匯合度為７０％。顯微鏡觀察：細(xì)胞單層貼壁生??長(zhǎng)，邊界清楚，致密排列呈束狀。??培養(yǎng)基的選擇，細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，ＤＭＥＭ培養(yǎng)基效果好于１６４０，盡??管１６４０培養(yǎng)基ＣＣＣ－ＨＩＥ－２可以生長(zhǎng)，但細(xì)胞形態(tài)偏瘦，不容易貼壁。圖３為??ＤＭＥＭ培養(yǎng)基中ＣＣＣ－ＨＩＥ－２單個(gè)細(xì)胞及細(xì)胞單層在顯微鏡下的形態(tài)�？梢钥吹�，??在ＤＭＥＭ培養(yǎng)基中，單個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)比較健康的細(xì)長(zhǎng)形態(tài)，貼壁良好。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)??至９０％融合度時(shí)，可以形成單細(xì)胞層。??ＣＣＣ－ＨＩＥ－２細(xì)胞?單層ＣＧＧ－ＨＩＥ－２細(xì)胞??圖３．光學(xué)顯微鏡下觀察ＣＣＣ－ＨＩＥ－２形態(tài)（放大倍數(shù)：１００ｘ）。左：?jiǎn)蝹�(gè)細(xì)胞形??態(tài)；右：細(xì)胞層形態(tài)。??Ｆｉｇｕｒｅ?３．?ＣＣＣ－ＨＩＥ－２?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｕｎｄｅｒ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ?（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：?ｌＯＯｘ）．?Ｌｅｆｔ：??ｓｉｎｇｌｅ?ｃｅｌｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；?Ｒｉｇｈｔ：?ｃｅｌｌ?ｌａｙｅｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．??２．?ＬＰＳ損傷腸上皮細(xì)胞模型的建立??腸上皮細(xì)胞是構(gòu)成腸粘膜的基本單元，是維持腸粘膜屏障的基礎(chǔ)，腸上皮細(xì)??胞的異常凋亡將直接導(dǎo)致腸屏障損傷，研究發(fā)現(xiàn)ＬＰＳ進(jìn)入腸道固有層引起腸粘??膜炎癥、腸上皮細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腸屏障損傷的主要原因，艾滋病相關(guān)的腸屏障損??傷循環(huán)標(biāo)記物的濃度只與ＬＰＳ依賴免疫激活的程度相關(guān)，與病毒載量無(wú)關(guān)，因??此我們通

２．１?ＬＰＳ導(dǎo)致ＣＣＣ－ＨＩＥ－２細(xì)胞增殖能力下降??首先我們使用不同濃度的ＬＰＳ致?lián)pＣＣＣ－Ｈｆｆｉ－２細(xì)胞，觀察ＬＰＳ對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)??的影響，并摸索導(dǎo)致細(xì)胞損傷的ＬＰＳ濃度，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。??１５０－１??〇＞??泛?１００－??ｈｌｌｍ＊??ｓｆ?ｖｆ?ｖｆ?＾?＾??圖４．?ＭＭＴ法檢檢測(cè)不同濃度ＬＰＳ對(duì)ＣＣＣ－ＨＩＥ－２細(xì)胞增殖的影響。（＊Ｐ＜０．０５?＊＊Ｐ＜０．０１）??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?ＭＭＴ?ａｓｓａｙ?ｔｏ?ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ?ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ＬＰＳ?ｏｎ?ｔｈｅ??ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＣＣＣ－ＨＩＥ－２?ｃｅｌｌｓ．?（＊Ｆ＜?０．０５?０．０１）??結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ｌＯＯｎｇ／ｍｌ?（尸＜０．０５）及１５０ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０１）的ＬＰＳ??作用于ＣＣＣ－ＨＩＥ－２細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)了顯著的增殖抑制。以１００ｎｇ／ｍｌ?ＬＰＳ作為??后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件。??２．２?ＬＰＳ促進(jìn)ＣＣＣ－ＨＩＥ－２細(xì)胞凋亡增加??為明確ＬＰＳ對(duì)ＣＣＣ－ＨＩＥ－２細(xì)胞凋亡的影響，用１００?ｎｇ／ｍｌ的ＬＰＳ處理細(xì)胞??后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)損傷細(xì)胞的凋亡情況。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＬＰＳ??罇＊?ｗ＞＂Ｔ??Ｑ１?Ｑ２?ｑｉ?Ｑ２??？０＊－??？ｃ１－??＊?■?ｉ?ｌ?ｉ?＜?１１｜?■?？?■?ｉ?ｔ－ｒ＊ｆ?９?？￣■?＊?＊＇？?■？！?？?？?＊?１?？?■?■?ｉｆ?Ｉ?ｉ?■－？＂ｎ?＿?■■?ｗ?■?Ｉｔ??？?？???????ｊ??ｉｅ°?？＊?？°?Ｍ＇


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