本文關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤中GLUT3基因異常表達(dá)的意義及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分：膠質(zhì)瘤中GLUT3的表達(dá)及其意義研究背景：膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的神經(jīng)上皮腫瘤之一,包括星形細(xì)胞腫瘤,少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤,混合性膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤和室管膜腫瘤。星形細(xì)胞瘤是膠質(zhì)瘤中最常見(jiàn)者,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)根據(jù)其生物學(xué)行為將其分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)。Ⅰ級(jí)：纖維型星形細(xì)胞瘤；Ⅱ級(jí)：低度惡性星形細(xì)胞瘤；Ⅲ級(jí)：間變型星形細(xì)胞瘤；Ⅳ級(jí)：多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。惡性膠質(zhì)瘤(malignant glioma, MG)主要包括Ⅲ級(jí)及Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤,約占到顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤的80%。由于膠質(zhì)瘤具有侵襲性生長(zhǎng)的生物學(xué)特性以及其生長(zhǎng)于腦或脊髓,生長(zhǎng)部位部位特殊,通常難以手術(shù)完全切除。血腦屏障的存在,阻礙了大部分化療藥物進(jìn)入腦組織內(nèi),從而化療也無(wú)法發(fā)揮其應(yīng)有的作用。放療雖然是各種類(lèi)型膠質(zhì)瘤常用的輔助治療方法,也只能在一定程度上延緩腫瘤的復(fù)發(fā)。目前即使采用手術(shù)+放療+化療等綜合治療手段,其預(yù)后也仍然相當(dāng)不樂(lè)觀。MG的中位生存期只有12-15個(gè)月,總體的五年生存率不足6%。因此探尋新的有效的治療方法是十分有必要的。這促使我們必須深入開(kāi)展對(duì)該疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)理、尤其是分子機(jī)理的研究,以尋找到更為有效的治療靶點(diǎn)。葡萄糖是大部分真核細(xì)胞的主要能量底物。水溶性的葡萄糖不能自由通過(guò)脂質(zhì)生物質(zhì)膜。葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞是葡萄糖參與代謝的關(guān)鍵限速步驟。葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)必須由一類(lèi)稱(chēng)之為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白家族協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)。這一家族目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的成員有14個(gè)。按照轉(zhuǎn)運(yùn)體之間序列結(jié)構(gòu)的相似性劃分,該蛋白家族可以劃分為三個(gè)亞家族：家族1 (GLUTs 1-4,14);家族2 (GLUTs 5, 7,9, and 11);與家族3 (GLUTs 6,8,10,12, and HMIT)。按照葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中鈉離子依賴(lài)與否,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員又可以分成鈉離子依賴(lài)型與非鈉離子依賴(lài)型兩大類(lèi)。鈉離子依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)體必須順鈉離子與葡萄糖濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子與葡萄糖,而非鈉離子型可以逆葡萄糖濃度主動(dòng)攝取葡糖糖。鈉離子依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)體主要表達(dá)在小腸的吸收上皮,與日常從飲食中攝取葡萄糖有關(guān)。此類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體還表達(dá)在腎臟上,參與葡萄糖的重吸收。非鈉離子依賴(lài)型轉(zhuǎn)運(yùn)體可以表達(dá)在絕大多數(shù)細(xì)胞上。這類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)具有一定的組織特異性。紅細(xì)胞主要表達(dá)GLUT1,肝臟主要表達(dá)GLUT2,肌肉和脂肪組織主要表達(dá)GLUT4。在腦內(nèi)這兩類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體均有表達(dá),只是表達(dá)的位置、轉(zhuǎn)運(yùn)能力、組織特異性有所不同。GLUT1在腦內(nèi)有兩種形式：糖基化程度高的GLUT1主要表達(dá)在腦血管壁上負(fù)責(zé)葡萄糖跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn),糖基化程度低的GLUT1主要分布于星型膠質(zhì)細(xì)胞的尾足與胞體上。GLUT2主要表達(dá)在下丘腦的神經(jīng)元上,是一個(gè)葡萄糖感受器,具有食物攝入調(diào)節(jié)功能。在下丘腦神經(jīng)元上GLUT2被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)突觸活性以及神經(jīng)遞質(zhì)釋放功能。GLUT3是大腦內(nèi)含量最多的轉(zhuǎn)運(yùn)體,其轉(zhuǎn)運(yùn)能力大約為GLUT1的5倍,主要分布于神經(jīng)元上,尤其是軸突與樹(shù)突上。GLUT3的分布密度與局部皮層葡萄糖消耗量相吻合。GLUT5是主要的果糖轉(zhuǎn)運(yùn)體,在腦內(nèi)GLUT5是小膠質(zhì)細(xì)胞上唯一的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體,并不分布于神經(jīng)元上。上述生理分布模式在病理狀態(tài)下會(huì)出現(xiàn)改變。在腦缺血缺氧過(guò)程早期中,GLUT3會(huì)出現(xiàn)增高,可以增加神經(jīng)元的葡萄糖攝取,提高神經(jīng)元的缺血缺氧耐受能力。用可以表達(dá)人的GLUT1與GLUT3的爪蟾卵實(shí)驗(yàn),將其置于低滲液中可以發(fā)現(xiàn)GLUT3的表達(dá)量呈指數(shù)形式增長(zhǎng)。糖尿病大鼠可以引起大腦皮層中GLUT3的表達(dá)增加。原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元給予葡萄糖剝奪48h,也可以使GLUT3 mRNA增加4倍。在生理?xiàng)l件下,GLUT3蛋白在膠質(zhì)細(xì)胞上難以檢出,但是隨著膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡變,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯升高,且與其病理分級(jí)呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。那么GLUT3在膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)具有什么意義?目的：首先通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的GLUT3以及Ki-67表達(dá)情況,明確膠質(zhì)瘤在演進(jìn)過(guò)程中GLUT3表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞增殖情況的關(guān)系。再用RNA干擾技術(shù)抑制膠質(zhì)瘤中GLUT3表達(dá),觀察由此對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)特性的改變。由此探明GLUT3在惡性膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)意義。(1).免疫組化方法檢測(cè)膠質(zhì)瘤甲醛固定石蠟包埋標(biāo)本中GLUT3, Ki-67的表達(dá)情況。方法：1)收集膠質(zhì)瘤WHO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)標(biāo)本,每級(jí)5例。2)用免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)本中GLUT3、Ki-67蛋白的表達(dá)量3)統(tǒng)計(jì)方法：應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。標(biāo)本中GLUT3(或Ki-67)蛋白的表達(dá)量以每100個(gè)細(xì)胞中GLUT3(或Ki-67)蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)計(jì)算,并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)方式表示,所有數(shù)據(jù)均為三次或以上重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果。兩組樣本之間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)加以分析；多組均數(shù)間比較：方差齊同時(shí)整體比較采用One-way ANOVA,組間兩兩比較采用LSD法；方差不齊時(shí)整體比較采用welch檢驗(yàn),組間兩兩比較采用Tamhane's檢驗(yàn)。GLUT3與Ki-67蛋白的表達(dá)量的相關(guān)性用Spearman相關(guān)方法加以分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為口=0.05。結(jié)果：1)隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高,樣本中GLUT3的表達(dá)陽(yáng)性率呈現(xiàn)逐級(jí)上升趨勢(shì)分別為：Ⅰ級(jí)：0.900±0.909%, Ⅱ級(jí)：13.420±3.653%,Ⅲ級(jí)：64.280±8.094%,Ⅳ級(jí)：93.340±5.212%,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),得levene統(tǒng)計(jì)量F=51.561,P0.001,說(shuō)明組間方差不齊,采用welch法行整體分析,welch統(tǒng)計(jì)量為6016.194,P0.001,組間兩兩比較采用Tamhane's方法,各組間比較P值均小于0.001,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2)隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高,樣本中Ki-67的表達(dá)陽(yáng)性率呈現(xiàn)逐級(jí)上升趨勢(shì)分別為：Ⅰ級(jí)：0.600±0.833%, Ⅱ級(jí)：11.140±4.291%,Ⅲ級(jí)：20.560±3.759%,Ⅳ級(jí)：31.500±4.896%,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),得levene統(tǒng)計(jì)量F=17.639,P0.001,說(shuō)明組間方差不齊,采用welch法行整體分析,welch統(tǒng)計(jì)量為1106.416, P0.001,組間兩兩比較采用Tamhane's方法,各組間比較P值均小于0.001,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3)在腫瘤內(nèi)部快速生長(zhǎng)區(qū)中的GLUT3與Ki-67表達(dá)量均高于慢速生長(zhǎng)區(qū)(GLUT3:93.340±5.212％/53.267±6.341%, t=-23.963, p0.001; Ki-67: 32.333±6.562% /21.333±5.158%, t=-7.224, P0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4)樣本中GLUT3的表達(dá)陽(yáng)性率與Ki-67的表達(dá)陽(yáng)性率呈呈正相關(guān)(spearman,rs=0.928,P0.001)。(2)抑制GLUT3表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)特性的影響方法：1)構(gòu)建GLUT3病毒干擾載體,包裝GLUT3干擾病毒顆粒Lv-GLUT3;2)檢驗(yàn)病毒Lv-GLUT3沉默GLUT3表達(dá)的效果；3)用MTT實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)Lv-GLUT3感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251,抑制GLUT3表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖速度的改變4)用傷口愈合實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)Lv-GLUT3感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251,抑制GLUT3表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的改變5)用transwell實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)Lv-GLUT3感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251,抑制GLUT3表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的改變6)用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)Lv-GLUT3感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251,抑制GLUT3表達(dá)后腫瘤細(xì)胞凋亡情況的改變7)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 17.0分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,所有數(shù)據(jù)均為三次或三次以上重復(fù)試驗(yàn)所得結(jié)果。對(duì)所測(cè)結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)以及方差齊性檢驗(yàn),正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),三組或三組以上均數(shù)比較采用方差分析,其中MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析方法進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05,P0.05認(rèn)定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1)所構(gòu)建的GLUT3病毒干擾載體Lv-GLUT3,可以高效的感染膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞。與感染陰性對(duì)照病毒顆粒Lv-NC組相比,感染Lv-GLUT3后可以使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GLUT3-mRNA的相對(duì)表達(dá)量下降(0.0000615±0.0000202/0.000647±0.000237,t=7.383,P0.001)以及GLUT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量下降(0.108±0.0159/0.364±0.0444,t=16.267,P0.001)。與感染陰性對(duì)照病毒顆粒Lv-NC組相比,感染Lv-GLUT3后可以明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中葡萄糖攝取量下降,反映在細(xì)胞培養(yǎng)留在液中的葡萄糖含量較對(duì)照組增高(0D505：0.532±0.0308/0.449±0.0322,t=-5.619,P0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2)MTT檢測(cè)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析方法加以分析,mauchly的W=0.758,P=0.125,滿足球形度檢驗(yàn),時(shí)間主效應(yīng)F=1734.375,P0.001,時(shí)間與組別的交互效應(yīng)檢測(cè)F=70.883,P0.001,處理組間比較有差別(F=800.730,P0.001)。與感染陰性對(duì)照病毒Lv-NC組相比,感染Lv-GLUT3后的48 h、72 h、96 h等時(shí)間點(diǎn)上,腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢于對(duì)照組,分別為：48h(0D490：0.780±0.0257/0.859±0.0157),72h(0D490：1.018±0.00677/1.206±0.0165),96h(0D490：0.929±0.0115/1.022±0.00387)。3)傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析方法加以分析,mauchly的W=0.930,P=0.304,滿足球形度檢驗(yàn),時(shí)間主效應(yīng)F=647.000,P0.001,時(shí)間與組別效應(yīng)F=23.164,P0.001.處理組間比較有差別(F=228.343,P0.001)。與感染陰性對(duì)照病毒Lv-NC組相比,感染病毒Lv-GLUT3后腫瘤細(xì)胞在12 h、24 h、 36 h等時(shí)間點(diǎn)上,傷口愈合能力降低,傷口未愈合面積比例分別為：12 h(0.779±0.0884/0.515±0.0721),24 h(0.565±0.121/0.211±0.0305),36 h(0.186±0.0744/0.0345±0.0386)。4) Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與感染陰性對(duì)照病毒Lv-NC組相比,感染病毒Lv-GLUT3后膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以侵透基質(zhì)膜到達(dá)下室的細(xì)胞數(shù)減少(14.400±3.851/67.267±10.053,經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)得t=19.019,P0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與感染陰性對(duì)照病毒Lv-NC組相比,感染病毒Lv-GLUT3后反映細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物--磷脂酰絲氨酸陽(yáng)性細(xì)胞比率增高(0.133±0.00290/0.0777±0.00630,經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)得t=23.757,P0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示感染Lv-GLUT3后膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡數(shù)增多。結(jié)論：1、GLUT3在膠質(zhì)瘤中出現(xiàn)異常表達(dá),并且隨著腫瘤級(jí)別增高而增高,在腫瘤內(nèi)部生長(zhǎng)快速區(qū)域表達(dá)量高于生長(zhǎng)慢速區(qū)域,GLUT3表達(dá)分布與反映細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67表達(dá)分布一致,說(shuō)明GLUT3的表達(dá)與細(xì)胞增殖速度情況平行。2、在膠質(zhì)瘤中抑制GLUT3表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增值速度,降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。第二部分 轉(zhuǎn)錄因子SP1參與膠質(zhì)瘤中GLUT3異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究背景：在惡性膠質(zhì)瘤中存在著GLUT3 mRNA的過(guò)度表達(dá),這提示GLUT3基因轉(zhuǎn)錄活性的升高�；虻霓D(zhuǎn)錄是指是以DNA單鏈為模板,在DNA依賴(lài)的RNA聚合酶催化下合成RNA鏈的過(guò)程。這一過(guò)程受到嚴(yán)密的調(diào)控�；虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)控主要由一類(lèi)被稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白(反式作用因子)與基因附近(通常在基因上游)的非編碼區(qū)內(nèi)特定DNA模塊(順式作用元件)結(jié)合,起到激活或者抑制基因表達(dá)的作用。因此基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要涉及到兩大類(lèi)因素：反式作用因子與順式作用元件。就基因序列而言,必須存在轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn),并且這些潛在結(jié)合位點(diǎn)沒(méi)有受到甲基化、乙�；刃揎�,可以被轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。就轉(zhuǎn)錄因子而言,典型的轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)構(gòu)上具有DNA結(jié)合域,可以識(shí)別結(jié)合特定的DNA序列。同一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)有很高的序列相似性,通常為6-20bp的一段短序列。轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)可以通過(guò)一些生物信息學(xué)軟件加以測(cè)算尋找。SP1是第一個(gè)確定的轉(zhuǎn)錄因子,屬于Spl/Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族。SP1在結(jié)構(gòu)上具有鋅指結(jié)構(gòu),可以通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)特異性地結(jié)合到DNA上富含GC的區(qū)域上,SP1識(shí)別的DNA序列為5'-(G/T)GGGCGG(G/A) (G/A) (C/T)-3'. Spl既是正常生長(zhǎng)發(fā)育所必須,也對(duì)多種腫瘤包括膠質(zhì)瘤發(fā)揮著重要影響。我們用TFsearch、 TESS等軟件對(duì)GLUT3啟動(dòng)子的DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行的分析發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域人、大鼠、小鼠具有高度同源性,它們都具有3個(gè)Spl的結(jié)合域。人的SP1結(jié)合位點(diǎn)分別位于GGGGCGTGGTGGCG GGCG (score,94.5), GGGGCGGGGGCGGGGG (score,91.8), GGGGGGTGGGGTGGGGTGGGG (score,90.4) [29]。這提示Sp1有可能通過(guò)與這些位點(diǎn)的結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。在小鼠和大鼠的神經(jīng)元中Sp1可與啟動(dòng)子的順式作用原件結(jié)合而降低GLUT3的表達(dá)。而在骨骼肌細(xì)胞中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)則顯示Sp1可以與三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)中一個(gè)相結(jié)合,并促進(jìn)(3LUT3的轉(zhuǎn)錄。上述這些發(fā)現(xiàn)一方面證實(shí)了Sp1確實(shí)參與了GLUT3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,另一方面又顯示SP1對(duì)GLUT3的調(diào)控存在著組織特異性。Guan H等報(bào)道,在222例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中58.6%的標(biāo)本中出現(xiàn)了SP1的高表達(dá),并且SP1的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤的WHO分級(jí)呈正相關(guān)。那么在膠質(zhì)瘤中SP1的異常表達(dá)與GLUT3的表達(dá)之間有何關(guān)系?目的：通過(guò)分析克隆人GLUT3基因的啟動(dòng)子,構(gòu)建SP1結(jié)合位點(diǎn)野生型與突變型GLUT3基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體以及SP1真核表達(dá)載體,觀察轉(zhuǎn)染SP1真核表達(dá)載體上調(diào)SP1表達(dá)對(duì)GLUT3基因的表達(dá)以及GLUT3基因啟動(dòng)子活性的影響,再通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)觀察在細(xì)胞內(nèi)SP1與GLUT3基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合關(guān)系。方法：1)構(gòu)建SP1真核表達(dá)載體pIRES2-ZsGreenl-SP1、培養(yǎng)U251細(xì)胞,分組分別轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreenl-SP1、空質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1、用RT-PCR檢測(cè)SP1、GLUT3、GAPDH的mRNA表達(dá)情況,分析SP1表達(dá)量及GLUT3表達(dá)量之間的關(guān)系。用免疫印跡方法檢測(cè)SP1、GLUT3、GAPDH的蛋白表達(dá)情況,分析SP1表達(dá)量及GLUT3表達(dá)量之間的關(guān)系。2)分析人GLUT3基因結(jié)構(gòu),擴(kuò)增出GLUT3基因啟動(dòng)子區(qū),并將其定向克隆到螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic中,構(gòu)建出SP1結(jié)合位點(diǎn)野生型螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-GLUT3-wt.將pGL3-GLUT3-wt以及空質(zhì)粒pGL3-basic分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)重組質(zhì)粒pGL3-GLUT3-wt中插入片段的啟動(dòng)子活性。3)分析GLUT3基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子SP1的潛在結(jié)合位點(diǎn),用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建SP1結(jié)合位點(diǎn)突變型螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-GLUT3-mut。4)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞,分組轉(zhuǎn)染pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1、 PGL3-GLUT3-mut+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1 以及 pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK +pIRES2-ZsGreenl培養(yǎng)后用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)三組細(xì)胞的啟動(dòng)子活性,觀察SP1結(jié)合位點(diǎn)在SP1上調(diào)GLUT3基因啟動(dòng)子活性中的作用。5)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞,甲醛固定,超聲打碎DNA后,用SPl抗體做染色質(zhì)免疫共沉淀,陽(yáng)性對(duì)照為細(xì)胞裂解液Input,陰性對(duì)照為小鼠IgG代替SP1抗體,以各組獲得DNA做模板,用SP1結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)引物行熒光定量PCR,觀察各組熒光強(qiáng)度,判斷在腫瘤細(xì)胞內(nèi)SP1是否結(jié)合于GLUT3基因的啟動(dòng)子上。6)使用SPSS 17.0分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,所有數(shù)據(jù)均為三次或三次以上重復(fù)試驗(yàn)所得結(jié)果。對(duì)所測(cè)結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)以及方差齊性檢驗(yàn),正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組均數(shù)間比較：方差齊同時(shí)整體比較采用One-way ANOVA,組間兩兩比較采用LSD法；方差不齊時(shí)整體比較采用welch檢驗(yàn),組間兩兩比較采用Tamhane's檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05。結(jié)果：1)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGL3-GLUT3-wt.pGL3-GLUT3-mut,pIRES2-ZsGreenl-SP1經(jīng)過(guò)測(cè)序,證實(shí)序列正確。2)與轉(zhuǎn)染空載體pIRES2-ZsGreenl組相比,轉(zhuǎn)染構(gòu)建的SPl真核表達(dá)載體pIRES2-ZsGreenl-SP1可以使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SP1-mRNA與GLUT3-mRNA相對(duì)表達(dá)量上升(SP1-mRNA/GADPH-mRNA:0.573±0.0900/0.0844±0.00919, t=-16.204, p 0.001:GLUT3-mRNA/GADPH-mRNA:0.513±0.0656/0.0392±0.0104, t=-21.401,p 0.001):SPl-protein與GLUT3-protein相對(duì)表達(dá)量上升(SP1-protein/GADPH-protein:0.414±0.0573/0.212±0.0394,t=-8.585. p 0.001:SP1-protein/GADPH-protein:0.337±0.0557/0.114±0.0400, t=-9.721,p 0.001).3)與轉(zhuǎn)染pGL3-basic+pRL-TK組相比,在轉(zhuǎn)染pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK組膠質(zhì)瘤中相對(duì)熒光素酶活性明顯增高(37.477±4.870/2.367±0.760,t=-21.370,P0.001)。4)轉(zhuǎn)染pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1組、轉(zhuǎn)染pGL3-GLUT3-mut+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1組和pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+ pIRES2-ZsGreenl組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性比較,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),得levene統(tǒng)計(jì)量F=2.294,P=0.123,說(shuō)明組間方差齊同,經(jīng)單因素方差分析,得F=45.514,P0.001整體差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中轉(zhuǎn)染pGL3-GLUT3-Wt+ pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性比轉(zhuǎn)染pGL3-GLUT3-mut+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1組和pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+ pIRES2-ZsGreen1組高(56.561±11.012/27.212±5.920,LSD,P0.001,6.561±11.012/25.841±4.726,LSD,P0.001)。其中pGL3-GLUT3-mut+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1組和pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl組中相對(duì)熒光素酶活性差異不大(27.212±5.920/25.841±4.726,LSD,p=0.710).結(jié)果提示GLUT3啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)SP1結(jié)合位是SP1上調(diào)GLUT3基因啟動(dòng)子活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。6)免疫共沉淀結(jié)果顯示：以各組獲得的DNA為模板,以SP1結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)引物行熒光定量PCR,各組相對(duì)熒光強(qiáng)度比較,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),得levene統(tǒng)計(jì)量F=7.560,P=0.003,說(shuō)明組間方差不齊,經(jīng)welch檢驗(yàn),得F=421.377,P0.001整體差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較結(jié)果顯示SPl抗體沉降組相對(duì)熒光強(qiáng)度低于Input組(236.206±56.688/459.069±44.985,Tamhane's,p 0.001),而高于小鼠IgG組(236.206±56.688/23.278±11.148,Tamhane's,p 0.001),上述結(jié)果提示在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SPl結(jié)合于GLUT3基因的啟動(dòng)子區(qū)。結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子SP1可以作用于GLUT3啟動(dòng)子區(qū)上SP1結(jié)合位點(diǎn),并上調(diào)GLUT3啟動(dòng)子活性。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)瘤 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3 SP1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 啟動(dòng)子
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-21
• 第一章 GLUT3在膠質(zhì)瘤中的異常表達(dá)及其意義21-69
• 引言21
• 第一節(jié) 膠質(zhì)瘤在演進(jìn)過(guò)程中GLUT3表達(dá)量與Ki-67表達(dá)量之間的相關(guān)性21-31
• 材料與試劑22-23
• 實(shí)驗(yàn)方法23-24
• 結(jié)果24-30
• 討論30-31
• 第二節(jié) 抑制GLUT3表達(dá)后對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)特性的影響31-69
• 第一小節(jié) GLUT3慢病毒干擾載體的構(gòu)建與鑒定31-56
• 材料與試劑31-33
• 方法33-47
• 結(jié)果47-55
• 討論55-56
• 第二小節(jié) 抑制GLUT3表達(dá)后對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)特性的影響56-69
• 材料與試劑56-58
• 方法58-61
• 結(jié)果61-67
• 討論67-69
• 第二章 SP1參與膠質(zhì)瘤中GLUT3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控69-116
• 引言69-70
• 第一節(jié) 在膠質(zhì)瘤中SP1對(duì)GLUT3基因表達(dá)的影響70-92
• 材料與試劑71-72
• 方法72-85
• 結(jié)果85-90
• 討論90-92
• 第二節(jié) SP1可以結(jié)合于GLUT3基因啟動(dòng)子區(qū),并激活GLUT3的轉(zhuǎn)錄92-116
• 材料與試劑92-93
• 方法93-108
• 結(jié)果108-113
• 討論113-116
• 全文總結(jié)116-118
• 后記與展望118-119
• 綜述119-130
• 參考文獻(xiàn)130-142
• 縮略詞表142-144
• 在學(xué)期間所發(fā)表論文144-145
• 致謝145-147
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明147

  本文關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤中GLUT3基因異常表達(dá)的意義及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：314503