發(fā)布時間：2021-04-06 16:48

　　人巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）屬于β型皰疹病毒,HCMV感染是先天性出生缺陷的主要病毒性病因,也是導(dǎo)致免疫抑制或免疫缺陷的患者產(chǎn)生嚴(yán)重疾病的重要病原。HCMV基因組在人類皰疹病毒中最大,核糖體圖譜技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組分析推斷其含有515個短的開放閱讀框（Small open reading frame,sm ORF）。然而,目前為止尚未完全明確HCMV sm ORF的編碼能力及其編碼的多肽（sm ORF-encoded polypeptide,SEP）的生物學(xué)功能。本研究主要是為了鑒定HCMV中具有編碼性的sm ORF,并探究其SEP的功能。在研究中,使用生物信息學(xué)分析并篩選出10種具有免疫原性的SEP,并制備其多克隆抗體,驗證了其中2種抗體（r ORF73與ORFL297C.i ORF1多肽抗體）的特異性較強。此外,在HCMV感染宿主細(xì)胞中檢測到病毒能夠表達(dá)的天然內(nèi)源性O(shè)RFL297C.i ORF1多肽,并通過瞬間轉(zhuǎn)染ORFL297C.i ORF1基因確認(rèn)其編碼能力。我們首次發(fā)現(xiàn)ORFL297C.i ORF1多肽具有促進(jìn)HCMV復(fù)制的活性;且ORFL29... 

【文章來源】：暨南大學(xué)廣東省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：153 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
    一、背景
        1 HCMV的形態(tài)與功能及基因組
        2 HCMV感染的預(yù)防與治療
        3 smORF及其編碼的多肽
        4 外部引導(dǎo)序列技術(shù)
    二、本研究的思路與目的意義
        1 研究思路
        2 研究目的與意義
第一部分 HCMV編碼性smORF的鑒定及其功能初探
    一、實驗材料
        1 質(zhì)粒、細(xì)菌株、病毒株、細(xì)胞與實驗動物
        2 主要試劑及溶液配制
        3 實驗儀器、耗材
    二、實驗方法
        1 HCMV smORF及其SEP生物信息學(xué)分析
        2 多肽的合成、溶解、含量測定及穩(wěn)定性分析
        3 多肽多克隆抗體的制備與純化
        4 多肽多克隆抗體效價的測定與特異性的檢驗
        5 目的基因質(zhì)粒的構(gòu)建
        6 細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)實驗
        7 病毒水平的基礎(chǔ)實驗
        8 HCMV編碼天然性多肽及其smORF編碼能力的確認(rèn)
        9 smORF的SEP的生物學(xué)功能初探
        10 統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)
    三、實驗結(jié)果
        1 HCMV smORF的篩選與目標(biāo)SEP序列的分析與功能預(yù)測
        2 合成的多肽具有較好的穩(wěn)定性
        3 多肽抗體的性能分析
        4 ORFL297C.iORF1 具有編碼多肽的能力
        5 ORFL297C.iORF1 多肽促進(jìn)HCMV的復(fù)制
        6 ORFL297C.iORF1 多肽抑制宿主的天然免疫應(yīng)答
    四、小結(jié)與討論
第二部分 EGS抑制HCMV MCP表達(dá)與復(fù)制的研究
    一、實驗材料
        1 細(xì)菌株、病毒株、細(xì)胞與質(zhì)粒載體
        2 主要試劑及溶液配制
    二、實驗方法
        1 細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)實驗
        2 EGS序列的設(shè)計
        3 EGS和反應(yīng)底物的制備
        4 EGS引導(dǎo)RNase P體外剪切活性的檢測
        5 穩(wěn)定表達(dá)EGS細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定
        6 EGS調(diào)控病毒復(fù)制與基因表達(dá)的檢測
        7 EGS調(diào)控病毒基因組DNA復(fù)制的檢測
        8 統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)
    三、實驗結(jié)果
        1 EGS引導(dǎo)RNase P對 MCP mRNA序列的體外剪切
        2 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)EGS及其細(xì)胞的低毒性
        3 EGS介導(dǎo)的HCMV MCP表達(dá)的抑制作用
        4 EGS靶向于MCP mRNA抑制HCMV的復(fù)制
        5 EGS引導(dǎo)RNase P剪切MCP mRNA抑制HCMV衣殼成熟
    四、小結(jié)與討論
全文總結(jié)與展望
    一、結(jié)論
    二、創(chuàng)新點
    三、展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    主要縮略詞中英文對照表
    合成多肽的鑒定與純度測定
攻讀博士學(xué)位期間的科研成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用合成多肽制備兔多克隆抗體[J]. 譚鳳彪,高家林,陸曉華,章堯.  皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2016(05)
[2]中藥抗人巨細(xì)胞病毒研究進(jìn)展[J]. 李維薇,楊燕,汪受傳.  中醫(yī)藥導(dǎo)報. 2016(05)
[3]釉成熟蛋白多肽多克隆抗體的制備和應(yīng)用[J]. 張娟娟,冀洪海,柳云霞,孫巖.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2015(09)
[4]中藥治療巨細(xì)胞病毒感染研究進(jìn)展[J]. 廖玲,王紅.  北京中醫(yī)藥. 2011(01)
[5]重組SARS-C oV未知功能小蛋白X5表達(dá)、純化及抗體制備[J]. 王麗娜,孔建強,朱平,杜冠華,王偉,程克棣.  藥學(xué)學(xué)報. 2008(11)



本文編號：3121773