缺血性腦卒中,又稱中風(fēng),是一種急性腦血管疾病,由血管狹窄或者堵塞造成腦組織血流灌注不足而引起。腦卒中造成不可逆的神經(jīng)損傷,嚴(yán)重影響患者的運(yùn)動(dòng)功能、感覺功能和認(rèn)知能力。目前腦卒中的臨床治療藥物十分有限,以溶栓藥組織型纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator,tPA）為主,但是tPA的使用受到很多限制,真正受益的患者很少。腦卒中復(fù)雜的病理機(jī)制是造成抗腦卒中藥物研發(fā)困難的主要原因之一。因此急需對(duì)腦卒中的病理機(jī)制進(jìn)行深入研究,并在此基礎(chǔ)上尋找潛在的藥物干預(yù)新靶標(biāo)。自噬是一種通過溶酶體途徑的細(xì)胞內(nèi)降解過程,自噬清除損傷蛋白和細(xì)胞器,對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)十分關(guān)鍵。本課題組前期研究表明,腦卒中后的血流復(fù)灌過程引發(fā)自噬激活,自噬通過清除損傷線粒體,即線粒體自噬,減少神經(jīng)元凋亡并減輕缺血性神經(jīng)損傷。線粒體外膜蛋白BNIP3L/NIX通過與自噬泡蛋白LC3相互作用介導(dǎo)了缺血/復(fù)灌過程中的線粒體自噬。然而,課題組前期研究初步發(fā)現(xiàn),在單一的缺血過程中神經(jīng)元雖有自噬激活,線粒體卻未被有效清除,即存在線粒體自噬缺失。如能明確缺血過程中神經(jīng)元的線粒體自噬缺失的機(jī)制并對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn),則可能為... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：105 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

線粒體自噬在小鼠永久性腦缺血中無法激活

為進(jìn)一步明確上述現(xiàn)象,體外培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元,經(jīng)氧糖剝奪再灌(O-R)或氧糖剝奪(OGD)處理后,同樣發(fā)現(xiàn)O-R和OGD均引起SQSTM1/GAPDH減少,LC3-II/GAPDH增加,提示在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中缺血后自噬仍然激活(圖1-2.A和B)。O-R引起線粒體膜蛋白COX4I1和TOMM20水平下降,而OGD則不能。為進(jìn)一步驗(yàn)證自噬的發(fā)生,使用溶酶體抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)。氯喹可以使溶酶體內(nèi)的pH升高,抑制自噬泡和溶酶體的結(jié)合,從而抑制自噬。蛋白免疫印跡的結(jié)果顯示僅在O-R中,給予氯喹可以使LC3-II/GAPDH進(jìn)一步累積,逆轉(zhuǎn)SQSTM1/GAPDH,COX4I1和TOMM20的減少,提示O-R中線粒體自噬激活,OGD則不能激活線粒體自噬。為進(jìn)一步明確永久性腦缺血后線粒體自噬缺失,在Atg7fl/fl小鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)5天后加入nestin-CRE病毒,得到自噬相關(guān)基因7(ATG7)敲除的神經(jīng)元,進(jìn)行O-R和OGD處理。ATG7是形成自噬的重要蛋白,該基因的缺失會(huì)抑制自噬泡的產(chǎn)生。免疫印跡的結(jié)果顯示,ATG7基因敲除抑制了自噬,表現(xiàn)為SQSTM1的累積,LC3-II的減少。在O-R神經(jīng)元中的線粒體膜蛋白COX4I1和TOMM20的含量隨自噬的抑制而累積,提示缺血再灌的神經(jīng)元中自噬抑制從而導(dǎo)致了線粒體自噬抑制。而OGD神經(jīng)元的線粒體無論在野生型或者ATG7基因敲除的神經(jīng)元中均無顯著性差異,提示自噬抑制并不影響永久性缺血神經(jīng)元中線粒體自噬(圖1-3 A和B)。以上結(jié)果表明抑制自噬不能影響OGD導(dǎo)致的線粒體自噬缺失,提示永久性腦缺血后線粒體自噬的缺失不是自噬缺失引起的。

為進(jìn)一步明確永久性腦缺血后線粒體自噬缺失,在Atg7fl/fl小鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)5天后加入nestin-CRE病毒,得到自噬相關(guān)基因7(ATG7)敲除的神經(jīng)元,進(jìn)行O-R和OGD處理。ATG7是形成自噬的重要蛋白,該基因的缺失會(huì)抑制自噬泡的產(chǎn)生。免疫印跡的結(jié)果顯示,ATG7基因敲除抑制了自噬,表現(xiàn)為SQSTM1的累積,LC3-II的減少。在O-R神經(jīng)元中的線粒體膜蛋白COX4I1和TOMM20的含量隨自噬的抑制而累積,提示缺血再灌的神經(jīng)元中自噬抑制從而導(dǎo)致了線粒體自噬抑制。而OGD神經(jīng)元的線粒體無論在野生型或者ATG7基因敲除的神經(jīng)元中均無顯著性差異,提示自噬抑制并不影響永久性缺血神經(jīng)元中線粒體自噬(圖1-3 A和B)。以上結(jié)果表明抑制自噬不能影響OGD導(dǎo)致的線粒體自噬缺失,提示永久性腦缺血后線粒體自噬的缺失不是自噬缺失引起的。為了更直接地觀察到線粒體自噬的發(fā)生,我們分別用標(biāo)記自噬泡的mCherry-LC3B和線粒體的Mito-GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)元,使用共聚焦顯微鏡觀察二者的共定位情況。共聚焦的結(jié)果顯示O-R和OGD處理均增加了自噬泡的數(shù)量,提示自噬的激活。O-R可以促使線粒體與自噬泡的融合,線粒體數(shù)量的減少;而只進(jìn)行OGD時(shí),出現(xiàn)大量的線粒體累積,線粒體與自噬泡并不融合,提示線粒體自噬功能障礙(圖1-4.A和B)。MitoQC同樣是檢測(cè)線粒體自噬的熒光探針。線粒體自噬未發(fā)生時(shí),細(xì)胞內(nèi)的線粒體同時(shí)被mCherry和GFP標(biāo)記,呈現(xiàn)黃色;當(dāng)線粒體自噬激活時(shí),線粒體被遞送到酸性溶酶體內(nèi),GFP被淬滅,因此線粒體只帶有mCherry熒光,呈現(xiàn)紅色。結(jié)果顯示在O-R減少了線粒體的含量(mCherry+),而OGD則相反,提示盡管自噬激活,但缺血不復(fù)灌的神經(jīng)元中線粒體自噬缺失。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Ubiquitin-proteasome system and oxidative stress in liver transplantation[J]. Norma Alva,Arnau Panisello-Roselló,Marta Flores,Joan Roselló-Catafau,Teresa Carbonell.  World Journal of Gastroenterology. 2018(31)
[2]Puerarin protects rat brain against ischemia/reperfusion injury by suppressing autophagy via the AMPK-mT OR-ULK1 signaling pathway[J]. Jin-Feng Wang,Zhi-Gang Mei,Yang Fu,Song-Bai Yang,Shi-Zhong Zhang,Wei-Feng Huang,Li Xiong,Hua-Jun Zhou,Wei Tao,Zhi-Tao Feng.  Neural Regeneration Research. 2018(06)
[3]Regulation of mitophagy in ischemic brain injury[J]. Yang Yuan,Xiangnan Zhang,Yanrong Zheng,Zhong Chen.  Neuroscience Bulletin. 2015(04)



本文編號(hào)：3034664