目的建立小鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells,EPCs）系作為細胞模型,采用RNA-seq技術(shù)結(jié)合生物信息學手段,分析人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）對小鼠骨髓EPCs增殖影響的差異表達基因及其主要意義,探討人參皂苷Rg1對小鼠骨髓EPCs促增殖作用的分子機制,為利用人參皂苷Rg1治療內(nèi)皮損傷性疾病提供分子生物學水平依據(jù),同時尋找促進EPCs體外生長的關(guān)鍵靶點,為培養(yǎng)數(shù)量充足、富有活力的EPCs提供新思路。方法1.采用全骨髓差速貼壁培養(yǎng)法與二次酶消化法相結(jié)合,分離和純化小鼠骨髓EPCs。通過形態(tài)學觀察、細胞表面抗原表達率檢測,進行所獲EPCs的細胞鑒定。2.在EPCs的傳代培養(yǎng)過程中,選擇增殖能力強的細胞,通過有限稀釋培養(yǎng)獲得單克隆細胞系,并進行傳代培養(yǎng)擴增。通過形態(tài)學觀察、生長特性觀察、細胞表面抗原檢測、核型分析、體外成血管實驗,進行所建細胞系MBMME2的鑒定。3.取小鼠骨髓EPCs的傳代細胞和細胞系MBMME2細胞,每種細胞分為7個組,即4個人參皂苷Rg1處理組（終濃度分別為5、10、15、20μmol/L）,空白對照組、溶... 

【文章來源】：湖南師范大學湖南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：130 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

EPCs的鑒定方法[36]

已有研究表明,人參提取物能競爭性與雌二醇、孕激素結(jié)合到后兩者受體位點上。人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1和Rc均具有雌激素樣作用[132]。Chao等在2002年以人乳腺癌細胞株研究人參皂苷Rg1的雌激素活性及其作用機制[133]。發(fā)現(xiàn)的濃度在10-15-10-7mol/L范圍內(nèi)的人參皂苷Rg1對MCF-7的增殖呈劑量依賴關(guān)系,并且最佳濃度為3×10-13mol/L。但是這種增殖能被特異的雌激素受體拮抗劑ICI182780(10-6mol/L)所抑制。因此認為人參皂苷Rg1具有雌激素樣活性,此外,人參皂苷Rg1能誘導(dǎo)雌激素調(diào)節(jié)基因p S2的表達。也有研究顯示:人參皂苷Rg1(1-100μg/mL)對B16F10和HUVEC細胞生長無顯著影響,但可以顯著促進CAM一級血管生成,對二級血管有不同程度的促進作用,腹腔注射人參皂苷Rg1,荷瘤鼠腫瘤體積抑制率為13.8%,瘤血管生成增殖率為18.1%,表明人參皂苷Rg1對荷瘤小鼠具有免疫增強活性[134]。Gao等認為人參皂苷Rg1在ER陽性細胞中可能的作用機制是通過形成含有小窩蛋白Caveolin、連接蛋白Shc、雌激素受體非基因組調(diào)節(jié)因子MNAR(modulator of nongenomic activity of ER)、胰島素樣生長因子受體IGFR(insulin-like growth factor-I receptor)和c-Src(cellular nonreceptor tyrosine kinase)的信號小體,激活ERα募集到質(zhì)膜,并誘導(dǎo)細胞內(nèi)Ca2+動員增加,然后激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體Gper-EGFR,誘導(dǎo)細胞內(nèi)c AMP的增加;在Ser118處引起MEK1/2磷酸化和ERα磷酸化,然后誘導(dǎo)ERE依賴型轉(zhuǎn)錄,最后激活雌激素受體效應(yīng)[135]。人參皂苷Rg1對ER陽性細胞可能的作用機制如圖1-2所示。相關(guān)研究結(jié)果顯示人參皂苷Rg1具有維持CNS刺激功能、抗疲勞、抗高血壓和增強智力的作用[105,128-129]。人參皂苷Rg1通過不同通路作用于不同的靶點,起著不同的作用;其可以通過細胞因子-細胞因子受體相互作用;MAPK信號通路,Toll樣受體信號通路、花生四烯酸代謝、細胞凋亡等信號通路進行調(diào)節(jié)[47,101,111,115-116]。通過這些信號通路與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境、信息處理,信號分子之間的相互作用,影響細胞生長和凋亡、脂質(zhì)代謝等。

小鼠骨髓單個核細胞接種入25 mL塑料培養(yǎng)瓶,倒置顯微鏡下觀察到細胞呈圓形,大多懸浮在培養(yǎng)液中,少量沉入瓶壁。培養(yǎng)2 h左右,可見有少量細胞貼壁,形態(tài)開始發(fā)生改變,由圓形變?yōu)椴灰?guī)則多邊形。隨著培養(yǎng)時間延長,貼壁細胞不斷增多。體外培養(yǎng)48 h內(nèi)貼壁的細胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)時,大多呈成纖維細胞樣的長梭形,少量呈短梭形(圖2-1-A)。這些長梭形細胞主要是間充質(zhì)干細胞擴增細胞,而短梭形細胞主要為內(nèi)皮祖細胞擴增細胞。開始培養(yǎng)后第二個48h期間(第49~96 h)貼壁的細胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)時,大多呈短梭形、圓形或多邊形,長梭形細胞很少(2-1-B)。當上述第49~96 h期間貼壁細胞生長至亞融合狀態(tài)時,經(jīng)二次酶消化法處理,將第二次酶消化獲取的細胞做傳代培養(yǎng)。細胞貼壁生長后,大多呈鵝卵石形、短梭形、三角形或圓形。在較低密度時,很多細胞排列成條索樣(圖2-2-A,B)。在較高密度時,細胞呈鋪路石樣排列(圖2-2-C,D)。由此可見,這些細胞具有體外培養(yǎng)條件下EPCs擴增細胞的典型形態(tài)學特征。

【參考文獻】：
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