發(fā)布時間：2017-04-06 18:03

  本文關(guān)鍵詞：雄芍湯干預(yù)DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的代謝組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分雄芍湯有效成份的含量測定目的通過對雄芍湯中粗多糖、總苷、總生物堿三個主要有效成份的含量進(jìn)行測定,保證雄芍湯藥物質(zhì)量可靠。方法雄芍湯采用常規(guī)水煎煮法作為提取方法。粗多糖分離采用醇沉法,除蛋白雜質(zhì)采用Sevage法;總苷分離采用水飽和正丁醇萃取法;總生物堿分離采用氨水乙醚冷浸法。雄芍湯粗多糖提取物中總多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法,總苷提取物中人參總皂苷的含量測定采用香草醛-冰醋酸-高氯酸紫外顯色法,雄芍湯總生物堿提取物中總堿的含量測定采用酸性染料比色法。結(jié)果粗多糖提取物中總多糖平均含量為541.62 mg/g;總苷提取物中人參總皂苷的含量為642.78mg/g;總生物堿提取物中總堿的平均含量為828.79mg/g。結(jié)論雄芍湯中粗多糖、總苷、總生物堿三個主要有效成份的提取方法有效,含量測定符合藥效學(xué)研究,雄芍湯質(zhì)量穩(wěn)定,為下一步動物實驗打好藥效學(xué)基礎(chǔ)。第二部分以NMR為基礎(chǔ)的DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型代謝組學(xué)研究目的通過二甲基亞硝胺(DMN)誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型,基于核磁共振技術(shù)(NMR)技術(shù)尋找大鼠尿液及血清中潛在的代謝物分子,對模型大鼠肝臟組織進(jìn)行代謝組學(xué)研究,為肝纖維化診斷提供一種新的無創(chuàng)性診斷方法。方法將52只SD雄性大鼠,采用隨機(jī)法分為正常對照組(以下簡稱為正常組)12只及肝纖維化模型組40只。給模型組大鼠腹腔注射DMN制備肝纖維化模型,按1ml/kg劑量注射1%DMN,隔日1次,每周3次,連續(xù)4周,正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模期間,模型組大鼠意外死亡7只。造模成功后,隨機(jī)抽取模型組大鼠6只、正常組大鼠6只取材。采用代謝籠收集正常組、模型組的24小時尿液后處死取材。觀察大鼠一般情況和新鮮肝臟;送檢血清肝功能指標(biāo)三項和血清肝纖維化標(biāo)志物四項;HE染色觀察肝組織病理學(xué)改變;基于NMR分析技術(shù)對模型大鼠和正常大鼠尿液及血液樣本進(jìn)行測定分析,采用SIMCA-P軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計分析,找尋DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化代謝損傷標(biāo)志物。結(jié)果對正常組和模型組的尿液圖譜進(jìn)行PCA分析顯示,模型組與正常組可明顯區(qū)分,正常組樣本大多位于PC1的負(fù)半軸,而模型組大多位于PC1的正半軸,說明通過肝纖維化造模后,模型組動物的尿液組成發(fā)生了較大變化。模型組大鼠尿液中苯乙酰甘氨酸、馬尿酸、胍基乙酸含量降低,而�；撬帷⒍∷猁}、琥珀酸鹽、N-乙酰天冬氨酸、2-羥基丁酸鹽含量升高。對正常組和模型組大鼠血清的CPMG譜進(jìn)行了主成分分析,正常與模型大鼠可明顯區(qū)分,與正常組相比,模型組中羥基丁酸、乳酸、醋酸、谷氨酸含量升高;β-葡萄糖、α-葡萄糖含量降低。對正常和模型大鼠led譜的主成分分析結(jié)果顯示,肝纖維化模型大鼠的大分子物質(zhì)也發(fā)生了改變。與正常組相比,模型組大鼠血清中HDL-CH3、N-乙酰葡萄糖胺、丙酮、-N(CH3)3、Lipid-CH=CH-升高;Lipid-CH2CH2CO、Lipid-CH2CH=、Lipid-CH2CO-、Lipid=CHCH2CH=、磷脂酰膽堿降低。結(jié)論我們在動物模型中尋找到這些代謝標(biāo)志物,它們的變化趨勢反應(yīng)了肝纖維化模型多種代謝功能失調(diào),如氨基酸、脂肪酸和葡萄糖等代謝紊亂,有很大潛能來作為肝纖維化的早期無創(chuàng)診斷線索。第三部分雄芍湯對DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型尿液及血清代謝損傷標(biāo)志物的干預(yù)目的應(yīng)用代謝組學(xué)平臺分析雄芍湯干預(yù)肝纖維化模型大鼠代謝損傷標(biāo)志物的變化趨勢。進(jìn)一步闡明雄芍湯具有良好的抗大鼠肝纖維化作用。方法造模成功的第2天開始,模型組剩余27只大鼠平均分為3組,模型組9只,雄芍湯組9只,扶正化瘀組9只。給扶正組9只;雄芍組9只分別灌胃相應(yīng)的雄芍湯水煎劑和扶正化瘀膠囊,給藥劑量分別以成人臨床劑量,推算出人每公斤體重用量,根據(jù)體型系數(shù)換算成大鼠用量。每日灌胃一次,連續(xù)4周。同時正常組及模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃,每日一次,連續(xù)4周。給藥結(jié)束后,采用代謝籠收集雄芍組、扶正組、模型組、正常組的24小時尿液后處死取血、取肝�；贜MR分析技術(shù)對雄芍組大鼠、扶正組大鼠、模型組大鼠和正常組大鼠的尿液及血液樣本進(jìn)行分析測定,同時采用SIMCA-P軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,探尋各組大鼠代謝損傷標(biāo)志物的變化趨勢。結(jié)果PCA分析顯示,正常組位于PC1的負(fù)半軸,而模型組大多位于PC1的正半軸,扶正組和雄芍組位于正常和模型組的中間,說明藥物干預(yù)后體現(xiàn)出明顯的治療作用,但尚未回歸到正常狀態(tài);此外,扶正組和雄芍組無明顯區(qū)分,說明從尿液代謝物的角度來看,兩組的治療效果接近。尿液代謝譜苯乙酰甘氨酸、胍基乙酸在模型組含量降低,給藥后扶正組和雄芍組均可使其含量升高,呈現(xiàn)回歸趨勢;琥珀酸鹽、丁酸鹽、2-羥基丁酸鹽在模型組中含量升高,給予扶正化瘀膠囊和雄芍湯后含量均降低,其中雄芍組可使三者均回歸至接近正常水平,而扶正只能使2-羥基丁酸鹽回歸至正常水平,說明二者的治療效果和作用機(jī)制有所不同。對正常組、模型組、扶正組、雄芍組的血液小分子物質(zhì)核磁譜進(jìn)行了PCA分析顯示,可見正常組位于PC1的負(fù)半軸,而模型組大多位于PC1的正半軸,扶正組和雄芍組位于正常和模型組的中間,說明藥物干預(yù)后體現(xiàn)出明顯的治療作用,但尚未回歸到正常狀態(tài);此外,雄芍組更接近正常組,說明從血清代謝物的角度來看,雄芍組的治療效果略好。α-Glucose和β-Glucose在模型組含量降低,給藥后扶正組和雄芍組均可使其含量升高,即呈現(xiàn)回歸趨勢,雄芍組回歸趨勢優(yōu)于扶正組;谷氨酸在肝纖維化模型組中含量升高,給予扶正化瘀膠囊和雄芍湯后其含量均降低,說明雄芍組和扶正組使其呈現(xiàn)回歸趨勢,且雄芍回歸趨勢效果優(yōu)于扶正組。對正常、模型、扶正、雄芍組血液大分子物質(zhì)的PCA分析結(jié)果顯示,正常組與模型組可區(qū)分,雄芍組與正常組重疊,但扶正組位于模型組上方,且遠(yuǎn)離正常組,因此,從血液大分子物質(zhì)的PCA分析結(jié)果來看,雄芍組體現(xiàn)出較好的治療效果,扶正組作用不明顯。結(jié)論雄芍湯能有效改善大鼠肝纖維化損傷標(biāo)志物代謝成分,使其回歸正常。雄芍湯抗肝纖維化作用,主要體現(xiàn)在對肝臟糖代謝及氨基酸代謝的有效干預(yù)。
【關(guān)鍵詞】：雄芍湯 代謝組學(xué) 大鼠 肝纖維化 二甲基亞硝胺
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 摘要8-12
• ABSTRACT12-19
• 英文縮略詞表19-20
• 前言20-23
• 參考文獻(xiàn)22-23
• 第一部分 雄芍湯有效成份的含量測定23-30
• 1 材料23-24
• 1.1 藥物與試劑23
• 1.2 儀器23-24
• 2 方法及結(jié)果24-28
• 2.1 雄芍湯粗多糖的提取和含量測定24-26
• 2.1.1 雄芍湯粗多糖的提取24-25
• 2.1.2 雄芍湯粗多糖的含量測定25-26
• 2.1.2.1 對照品溶液的制備25
• 2.1.2.2 供試品溶液的制備25
• 2.1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制25
• 2.1.2.4 樣品的測定25-26
• 2.2 雄芍湯總生物堿的提取和含量測定26-27
• 2.2.1 雄芍湯總生物堿的提取26
• 2.2.2 雄芍湯總生物堿的含量測定26-27
• 2.2.2.1 供試品溶液的制備26
• 2.2.2.2 測定方法26
• 2.2.2.3 樣品的測定26-27
• 2.3 雄芍湯總苷的提取和含量測定27-28
• 2.3.1 雄芍湯總苷的提取27
• 2.3.2 雄芍湯總苷提取物中人參總皂苷的含量測定27-28
• 2.3.2.1 對照品溶液的制備27
• 2.3.2.2 供試品溶液的制備27
• 2.3.2.3 樣品的測定27-28
• 3 討論28-29
• 3.1 供試品溶液提取工藝的選擇28
• 3.2 測定方法的選擇28-29
• 參考文獻(xiàn)29-30
• 第二部分 以NMR為基礎(chǔ)的DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型代謝組學(xué)研究30-53
• 1 材料30-31
• 1.1 實驗動物30
• 1.2 試劑30-31
• 1.3 實驗儀器31
• 2 方法31-33
• 2.1 造模31-32
• 2.1.1 肝纖維化模型制備31
• 2.1.2 動物分組31-32
• 2.2 動物標(biāo)本獲取和處理32-33
• 2.2.1 血清制備32
• 2.2.2 肝臟組織處理32
• 2.2.3 尿樣收集方法和處理方法32-33
• 2.3 觀測方法及指標(biāo)檢測33
• 2.3.1 癥狀觀察33
• 2.3.2 組織病理學(xué)檢查33
• 2.3.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測33
• 3 結(jié)果33-47
• 3.1 大鼠的一般情況33-34
• 3.2 肝功能指標(biāo)的檢測34
• 3.3 肝纖維化標(biāo)志物的檢測34
• 3.4 肝組織形態(tài)學(xué)觀察34-35
• 3.5 尿液代謝組學(xué)分析35-40
• 3.5.1 尿液處理方法35-36
• 3.5.2 NMR分析條件36
• 3.5.3 NMR圖譜預(yù)處理36
• 3.5.4 尿液代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果36-40
• 3.5.4.1 尿液代謝物指認(rèn)36-38
• 3.5.4.2 尿液樣本中潛在生物標(biāo)志物的尋找38-40
• 3.6 血清代謝組學(xué)分析40-47
• 3.6.1 血清樣本處理40-41
• 3.6.2 NMR分析條件41
• 3.6.3 NMR圖譜處理41
• 3.6.4 血清代謝組學(xué)分析結(jié)果41-47
• 3.6.4.1 血清代謝物指認(rèn)41-43
• 3.6.4.2 血清中小分子物質(zhì)譜（CPMG）中生物標(biāo)志物的確定43-45
• 3.6.4.3 血清中大分子物質(zhì)譜（LED）中生物標(biāo)志物的確定45-47
• 4.討論47-51
• 4.1 造模方法的選擇47
• 4.2 樣品的采集47-48
• 4.3 目前診斷肝纖維化常規(guī)指標(biāo)及缺陷48
• 4.4 尿液代謝物分析48-49
• 4.5 血清代謝物分析49-50
• 4.6 代謝組學(xué)實驗指標(biāo)對肝纖維化診斷的意義50-51
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 第三部分 雄芍湯對DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型尿液及血清代謝損傷標(biāo)志物的干預(yù)53-71
• 1 材料53-54
• 1.1 動物53
• 1.2 試劑與實驗儀器53-54
• 1.3 藥物54
• 2 方法54-55
• 2.1 分組給藥54
• 2.2 樣品采集54-55
• 2.3 尿樣處理方法55
• 2.4 血清處理方法55
• 3 結(jié)果55-64
• 3.1 大鼠的一般情況55-56
• 3.2 肝功能指標(biāo)的檢測56
• 3.3 肝纖維化標(biāo)志物的檢測56
• 3.4 肝組織形態(tài)學(xué)觀察56-57
• 3.5 尿液代謝組學(xué)分析結(jié)果57-60
• 3.6 血清代謝組學(xué)分析結(jié)果60-64
• 4 討論64-70
• 4.1 雄芍湯提出的中醫(yī)理論依據(jù)及方藥分析64-67
• 4.2 雄芍湯抗肝纖維化的療效分析67-68
• 4.3 雄芍湯抗肝纖維化的代謝組學(xué)研究68-70
• 參考文獻(xiàn)70-71
• 結(jié)語71-72
• 附錄一 肝臟的物質(zhì)代謝及中醫(yī)抗肝纖維化的治療進(jìn)展72-86
• 附錄二 讀博士期間發(fā)表論文、科研情況86-87
• 致謝87

  本文關(guān)鍵詞：雄芍湯干預(yù)DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的代謝組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：289355