本文關(guān)鍵詞：阿托伐他汀對大鼠主動脈自然衰老的干預(yù)作用及機(jī)制探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：世界性的人口老齡化問題明確地是指全球總?cè)丝跀?shù)量中,年輕人口比重減少,而年長人口比重增大從而造成年長老年群體比例相應(yīng)大幅度上升所帶來的諸多社會性問題與矛盾。這是在上世紀(jì)八十年代世界衛(wèi)生組織經(jīng)過全球人口結(jié)構(gòu)調(diào)查所發(fā)現(xiàn)的。據(jù)歐美等發(fā)達(dá)國家人口普查的研究來看,世界性的人口老齡化在歷史演變過程中是從未出現(xiàn)的一種社會現(xiàn)象。在某些現(xiàn)代社會學(xué)家的研究看來,它是一種歷史進(jìn)步的標(biāo)志。從根本上來講,這種人口結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展、教育水平提高以及醫(yī)療進(jìn)步所帶來的成就,也是克服傳染性疾病、克服營養(yǎng)不良、保證飲用水安全以及降低母嬰死亡率等公衛(wèi)事業(yè)良好發(fā)展的必然結(jié)果。即便如此,根據(jù)目前的調(diào)查數(shù)據(jù),到2015年,我國大陸地區(qū)60歲以上的老年人口將到達(dá)2.43億,占大陸總?cè)丝诘?5.2%；預(yù)計(jì)到2020年,這一比例將會高達(dá)19%。按照國家衛(wèi)計(jì)委統(tǒng)計(jì)審核慣例,65歲以上人口比例超過總?cè)丝诘?%,就被稱為老齡化社會。顯然我國已經(jīng)進(jìn)入了老齡化社會。根據(jù)全國第六次人口普查的數(shù)據(jù)顯示,我國共有26個(gè)省份和直轄市已經(jīng)步入老齡化社會階段。據(jù)專家推測,“十二五”末期,上述省份老年人口還將以超過3%的速度進(jìn)行增長。這意味著,我國的老齡化進(jìn)程還在進(jìn)一步加劇,接踵而來的諸多如老年人群體醫(yī)療、康復(fù)、護(hù)理以及公共衛(wèi)生服務(wù)等問題將會顯得日益突出和嚴(yán)重。目前全社會均在提倡宣傳健康老年化,促進(jìn)老年人群健康與改善老齡階段的生活質(zhì)量是廣大醫(yī)護(hù)工作者和全社會各行業(yè)參與者的共同使命。美國老年醫(yī)學(xué)會(American Geriatrics Society, AGS)在2013年科學(xué)年會中明確指出：“機(jī)體衰老造成相關(guān)功能的喪失是由機(jī)體本身生理機(jī)能障礙所引起,通過內(nèi)科的相應(yīng)治療很大程度上是可以改善這些生理功能的障礙”。理論上延緩和改變衰老時(shí)觸發(fā)的分子生物和生化等環(huán)節(jié)的變化,改變衰老相關(guān)生理狀況,提高對衰老相關(guān)失調(diào)狀況的耐受性,那么老年人群的生活質(zhì)量就可以提高,人類壽命就可以延長。探尋機(jī)體衰老的相關(guān)分子靶點(diǎn)并進(jìn)行切實(shí)有效地干預(yù)就成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)與焦點(diǎn)。隨著全球化的老年人口迅猛增長,我國與歐美等發(fā)達(dá)國家的老年相關(guān)性疾病如腦卒中、冠心病、高血壓、糖尿病等等的發(fā)展趨勢也都在集中動態(tài)演變。而以動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)為主要病理生理特征的心腦血管疾病尤為突出,其發(fā)病率、病死率和致殘率正逐步上升,其中之一的重要因素就在于當(dāng)前社會人口老齡化的現(xiàn)象日益嚴(yán)重,隨著年齡的增長,心腦血管疾病患病率持續(xù)升高,因而針對AS發(fā)病機(jī)制及防治策略的研究就顯得格外重要。引發(fā)AS的主要危險(xiǎn)因素包括有肥胖、高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病、吸煙、年齡等。由于社會老齡化問題的日益突出,從而將年齡在AS發(fā)病機(jī)制中所發(fā)揮的關(guān)鍵角色進(jìn)行研究已開始受到廣泛關(guān)注,并逐漸成為干預(yù)與治療AS的新靶點(diǎn)。通過流行病學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),伴隨年齡的增長,AS的發(fā)病率會急劇增高。這其中主要的原因在于血管隨著整個(gè)機(jī)體都在進(jìn)行相應(yīng)地老化,主要表現(xiàn)為血管結(jié)構(gòu)與血管構(gòu)成細(xì)胞的功能衰退,血管逐漸喪失原有機(jī)能,導(dǎo)致動脈順應(yīng)性下降、管腔擴(kuò)大而彈性回縮能力減退,血管壁基質(zhì)成分的改變。因此單列于動脈粥樣硬化之外的這些血管衰老改變更進(jìn)一步地促進(jìn)了心血管病變部位的病理生理演變,從而在一定程度上增加了老年人群患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)性,也加重了患病后的嚴(yán)重程度,妨礙了患者的預(yù)后恢復(fù)程度。當(dāng)前在社會人口結(jié)構(gòu)正逐漸向老齡化過度的背景下,防治AS則顯得更加關(guān)鍵。如何去闡明年齡增長會給血管帶來如此繁多的變化,血管組成細(xì)胞為什么會發(fā)生衰老,隱藏在血管衰老背后的細(xì)胞與分子生物學(xué)機(jī)制究竟是什么?這些都需要通過進(jìn)一步研究來逐一解答。作為3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase, HMG-CoA reductase)的選擇性抑制劑,阿托伐他汀通過抑制]HMG-CoA還原酶在肝臟與膽固醇的生物合成,從而降低血漿膽固醇和脂蛋白的水平,達(dá)到調(diào)節(jié)血脂的作用。此外在具有糖尿病、癥狀性動脈粥樣硬化性疾病等冠心病危險(xiǎn)因素合并血脂異常水平的患者中,可以降低非致死性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn),降低腦卒中和血管重建術(shù)的風(fēng)險(xiǎn),從而達(dá)到防治心腦血管相關(guān)疾病的作用。在以往的動物體內(nèi)或者離體細(xì)胞研究中,針對血管功能障礙的干預(yù)方式主要是實(shí)施強(qiáng)加干預(yù)導(dǎo)致急性血管功能障礙為主的研究模型。而這樣的研究模型顯然不能很好地模擬生物機(jī)體衰老這一緩慢漸進(jìn)的發(fā)生發(fā)展過程,因此建立自然衰老的體外與體內(nèi)模型是我們亟需有待解決的關(guān)鍵問題。目前的研究發(fā)現(xiàn),阿托伐他汀除了降低血脂的作用以外,還有其他心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。這些多效性的作用在血管壁結(jié)構(gòu)中發(fā)揮其保護(hù)功能主要?dú)w結(jié)于抗氧化、抗炎癥以及通過促進(jìn)一氧化氮(Nitric oxide, NO)的生物活性改善血管內(nèi)皮功能等等。在小鼠的心肌梗死模型中,阿托伐他汀能夠促進(jìn)心肌中新生血管的形成。而在細(xì)胞與分子水平,阿托伐他汀能夠激活內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial NO synthase, eNOS)并增加NO的生成。而在以往急性的血管應(yīng)激損傷模型中發(fā)現(xiàn),一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)的另一種同形異構(gòu)體,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible Nitric oxide synthase, iNOS)的表達(dá)上調(diào),而促進(jìn)血管調(diào)節(jié)舒張的NO生成下降。因此推測eNOS/iNOS-NO在維系血管正常功能的狀態(tài)下發(fā)揮著非常重要的作用。而在緩慢的血管衰老模型中又將會是怎樣的一種情況,則需要更加深入的進(jìn)行研究。根據(jù)報(bào)道,有很多的信號通路參與了在衰老過程中的信息調(diào)控。這些通路中的很多單獨(dú)組件,通過基因控制被證實(shí)了而作為藥物開發(fā)的靶點(diǎn)。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent Information Regulator 1, SIRT1)就是其中一個(gè)靶點(diǎn)。基于研究發(fā)現(xiàn),SIRT1的位置在能量感應(yīng)和調(diào)控應(yīng)激耐受等信號通路的十字路口,而將其編碼基因稱為“長壽基因”。在能量限制(Calorie restriction, CR)期間,它可能會更好地調(diào)控壽命。因此有學(xué)者通過饑餓、營養(yǎng)脅迫和高脂飲食等方式來激發(fā)SIRT1活性的表達(dá)。那么在自然衰老的情況下,SIRT1究竟對血管老化以及細(xì)胞衰老有什么樣的作用呢?SIRT1與NOS-NO系統(tǒng)有無相關(guān)的聯(lián)系呢?基于上述的研究背景,我們設(shè)想自然衰老過程會相應(yīng)引起血管組織及血管細(xì)胞的衰老,隨著年齡增長而伴隨著氧化應(yīng)激以及NOS系統(tǒng)失調(diào)的情況,容易發(fā)展到AS階段；阿托伐他汀可能延緩衰老的進(jìn)展；SIRT1在這一過程中能夠被激活與NOS-NO系統(tǒng)相互作用從而發(fā)揮保護(hù)血管及血管細(xì)胞的作用。本研究以自然衰老模型為代表,做以下三個(gè)環(huán)節(jié)的研究。一、自然倍增誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)衰老及阿托伐他汀干預(yù)作用研究首先根據(jù)前期課題組在老年鼠分離培養(yǎng)胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用改進(jìn)體外培養(yǎng)傳代復(fù)制性衰老的方式,獲得體外細(xì)胞培養(yǎng)模擬細(xì)胞衰老模型。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞依據(jù)群體倍增水平(population doubling level, PDL)分4組：青年組(6PDL),中年組(14PDL),老年組(24PDL),老年藥物組(于中年組時(shí)期細(xì)胞培養(yǎng)液中開始定量添加阿托伐他汀溶解藥物直至老年組時(shí)期,劑量為10μmol/L)。按照藥物和各組干預(yù)時(shí)間終點(diǎn)后,采用免疫組織化學(xué)染色法觀察衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶的活性,采用CCK-8法與流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期來觀察細(xì)胞增殖能力。采用JC-1與TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。然后觀察細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)：丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性及NOS系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)(NO的總含量,NOS活性)的變化。Real-time PCR測定NOS系統(tǒng)(eNOS與iNOS) mRNA的含量,免疫印跡法測定eNOS與iNOS的蛋白表達(dá),免疫熒光法觀察eNOS與iNOS的細(xì)胞定位及表達(dá)情況。結(jié)果表明：(1)隨著細(xì)胞傳代的延續(xù),VSMC出現(xiàn)衰老表型(F=156.751,P0.001),與青年組、中年組比較,老年組SA-β半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞百分比和細(xì)胞周期檢測G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(P0.05)。(2)細(xì)胞內(nèi)MDA含量增加(F=38.640,P0.001),SOD活性下降(F=191.888,P0.001),表明體外培養(yǎng)傳代模型成功誘導(dǎo)VSMC衰老,提示氧化應(yīng)激是血管平滑肌細(xì)胞衰老的重要機(jī)制。NO含量降低(F=28.736,P0.001),鈣依賴性NOS活性隨細(xì)胞傳代次數(shù)增加而下降(F=67.070,P0.001),非鈣依賴性NOS活性增加(F=67.070,P0.001)。隨傳代次數(shù)的逐漸增加,eNOS的表達(dá)下降(F=187.907,P0.001),而iNOS的表達(dá)升高(F=329.748,P0.001),eNOS/iNOS的比值逐漸下降,提示NOS系統(tǒng)失調(diào)也是血管細(xì)胞衰老的重要機(jī)制之一。(3)與老年組比較,老年藥物組通過較長時(shí)期的阿托伐他汀干預(yù)后SOD的活性增加(P0.05),MDA含量減少(P0.05),提高了NO的含量以及鈣依賴性NOS活性(P0.05),降低了非鈣依賴性NOS的活性(P0.05)。免疫熒光發(fā)現(xiàn)NOS系統(tǒng)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),隨著傳代次數(shù)的遞增,而eNOS的熒光強(qiáng)度逐漸下降,iNOS的熒光強(qiáng)度逐漸升高,老年藥物組能抑制iNOS的表達(dá)并通過增力eNOS的表達(dá)而使得失衡的NOS系統(tǒng)趨于平衡。二、自然增齡誘導(dǎo)大鼠主動脈血管衰老及阿托伐他汀干預(yù)作用為進(jìn)一步探討氧化應(yīng)激與NOS系統(tǒng)失衡在血管衰老中的作用,我們又從自然衰老動物模型的角度觀察了增齡過程中主動脈血管的變化情況以及阿托伐他汀干預(yù)后的相應(yīng)影響。實(shí)驗(yàn)分為四組：青年鼠組(2月齡,n=8),中年鼠組(12月齡,n=8),老年鼠組(20月齡,n=8),老年鼠藥物組(從12月齡開始添加含有阿托伐他汀的復(fù)合飼料喂養(yǎng)至20月齡,n=8,劑量為5mg/kg·d)。依照各組的干預(yù)終點(diǎn),開胸取胸主動脈,檢測血管環(huán)張力變化；運(yùn)用免疫組化染色法觀察衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性；觀察細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)：MDA的含量與SOD的活性；針對NOS系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)來檢測NO總含量和NOS的活性。Real-timePCR測定eNOS與iNOS mRNA的含量,免疫印跡法測定eNOS與iNOS的蛋白表達(dá),免疫組織化學(xué)法觀察eNOS與iNOS的表達(dá)情況。結(jié)果表明：(1)隨著增齡改變,內(nèi)皮依賴的血管舒張功能顯著下降(F=70.346,P0.001),非內(nèi)皮依賴的舒張功能也有下降趨勢。阿托伐他汀干預(yù)后可以改善血管舒張功能(P0.05)。(2)伴隨年齡增長,與青年鼠組和中年鼠組比較,老年鼠組SA-β-半乳糖苷酶染色的陽性細(xì)胞光密度值增加(F=79.486,P0.001)。(3)主動脈標(biāo)本中,老年鼠組MDA含量增加(F=132.420,P0.001),SOD活性下降(F=241.340,P0.001),表明活體組織增齡改變成功誘導(dǎo)主動脈血管衰老,提示氧化應(yīng)激是血管老化的重要機(jī)制之一。NO的含量降低(F=27.208,P0.001),鈣依賴性NOS活性隨年齡增長而下降(F=86.555,P0.001),非鈣依賴性NOS活性增加(F=86.555,P0.001)。隨年齡的逐漸增長,eNOS的表達(dá)下降(F=141.618,P0.001),而iNOS的表達(dá)升高(t=-10.903,P0.001),eNOS/iNOS的比值逐漸下降,提示NOS系統(tǒng)失調(diào)也是血管衰老的重要機(jī)制之一。(4)與老年鼠組比較,老年鼠藥物組通過阿托伐他汀長期干預(yù)后SOD的活性增加(P0.05),MDA的含量減少(P0.05),并且提高了NO的含量以及鈣依賴性NOS活性(P0.05),降低了非鈣依賴性NOS的活性(P0.01)。免疫組化發(fā)現(xiàn)隨著年齡的遞增,eNOS的表達(dá)逐漸下降,而iNOS在老年組表達(dá)最高,阿托伐他汀干預(yù)后能抑制老年鼠藥物組iNOS的表達(dá)并通過增加eNOS的表達(dá)而使得失衡的NOS系統(tǒng)趨于平衡。三、SIRT1在大鼠胸主動脈血管和平滑肌細(xì)胞衰老中的作用及阿托伐他汀的干預(yù)機(jī)制為進(jìn)一步探討SIRT1在自然衰老模型中發(fā)揮的作用以及阿托伐他汀的干預(yù)影響,我們分別對各組主動脈血管組織和血管平滑肌細(xì)胞中的SIRT1表達(dá)進(jìn)行了檢測。1、在血管平滑肌細(xì)胞中,運(yùn)用Real-time定量PCR法測定SIRT1 mRNA的含量,免疫印跡法檢鋇SIRT1的蛋白表達(dá),免疫熒光法定位SIRT1在細(xì)胞中的表達(dá)區(qū)域與情況。結(jié)果提示：(1)SIRT1主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi),隨著細(xì)胞傳代衰老(F=267.107,P0.001),老年組SIRT1的表達(dá)明顯低于中年組(P0.05)和青年鼠組(P0.05)。而通過阿托伐他汀的干預(yù)后,與老年鼠組比較,老年鼠藥物組SIRT1的表達(dá)上調(diào)(P0.05)。(2)血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1與NOS系統(tǒng)的相關(guān)性分析顯示：SIRT1的表達(dá)與eNOS呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.919,P0.001),與iNOS呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.988,P0.01)。而SIRT1與NOS系統(tǒng)的比值也呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.932,P0.01)。2、在主動脈血管中,運(yùn)用Real-time定量PCR法測定SIRTlmRNA的含量,免疫印跡法檢測SIRT1蛋白的表達(dá),免疫組化法定位SIRT1在主動脈中的表達(dá)區(qū)域與情況。結(jié)果提示：(1)隨著主動脈增齡衰老(F=168.199,P0.001),老年組SIRT1的表達(dá)明顯低于中年組(P0.05)和青年組(P0.05)。而通過阿托伐他汀的干預(yù)后,與老年組比較,老年藥物組SIRT1的表達(dá)上調(diào)(P0.05)。(2)主動脈中SIRT1與NOS系統(tǒng)的相關(guān)性分析顯示：SIRT1的表達(dá)與eNOS呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.975,P0.001),與iNOS呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.972,P＜0.001)。而SIRT1與NOS系統(tǒng)的比值也呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.989,P0.001)。通過以上針對體內(nèi)主動脈血管組織及體外血管平滑肌細(xì)胞的衰老模型研究,可以推斷eNOS/iNOS的比值與SIRT1存在正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論：通過本研究,我們能夠得出以下結(jié)論：1、通過體外傳代模擬細(xì)胞自然衰老,會出現(xiàn)氧化應(yīng)激程度加重與NOS系統(tǒng)失調(diào)。這些提示細(xì)胞衰老會增加胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的情況,在下調(diào)eNOS表達(dá)的同時(shí),會上調(diào)iNOS,繼而造成NOS系統(tǒng)比值的平衡失調(diào)。2、通過自然增齡模擬體內(nèi)主動脈衰老,造成血管舒張功能出現(xiàn)障礙。這提示伴隨衰老會加重血管中氧化應(yīng)激程度,加重NOS系統(tǒng)的失調(diào),減少NO在老齡鼠主動脈中的生物利用度,血管舒張功能發(fā)生改變。3、在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行長期阿托伐他汀的干預(yù),既可以在細(xì)胞中減輕氧化應(yīng)激帶來的損傷,恢復(fù)NOS系統(tǒng)的平衡,又可以在主動脈血管中提高NO的生物利用度,改善血管的舒張功能。4、血管組織老化與血管平滑肌細(xì)胞衰老過程中,SIRT1的表達(dá)逐漸下調(diào),與NOS系統(tǒng)的平衡失調(diào)有關(guān)。阿托伐他汀可通過上調(diào)SIRT1的表達(dá),并維系eNOS/iNOS的平衡,從而達(dá)到保護(hù)血管延緩血管衰老的目的。
【關(guān)鍵詞】：衰老 阿托伐他汀 主動脈 血管平滑肌細(xì)胞 SIRT1 eNOS
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-24
• 前言24-27
• 第一章 自然倍增誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞衰老及阿托伐他汀的干預(yù)作用27-74
• 材料與方法27-45
• 結(jié)果45-60
• 討論60-74
• 第二章 自然增齡誘導(dǎo)大鼠胸主動脈血管衰老及阿托伐他汀的干預(yù)作用74-108
• 材料與方法74-84
• 結(jié)果84-99
• 討論99-108
• 第三章 SIRT1在阿托伐他汀干預(yù)血管組織和細(xì)胞衰老中的作用以及與NOS系統(tǒng)的相關(guān)性探討108-122
• 材料與方法108-110
• 結(jié)果110-118
• 討論118-122
• 結(jié)論122-123
• 本研究的創(chuàng)新和不足之處123-124
• 英文縮寫詞表124-125
• 參考文獻(xiàn)125-136
• 綜述136-147
• 參考文獻(xiàn)143-147
• 論文發(fā)表情況147-149
• 致謝149-151
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明151

  本文關(guān)鍵詞：阿托伐他汀對大鼠主動脈自然衰老的干預(yù)作用及機(jī)制探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：289106