發(fā)布時間：2020-11-21 17:24

　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是導致不穩(wěn)定冠狀動脈綜合征和心源性猝死的重要原因之一,流行病學統(tǒng)計結(jié)果顯示,自2015年以來亞洲眾多國家中因脂代謝異常引發(fā)AS導致的心血管疾病發(fā)病率急劇上升,已成為除傳染性疾病外有較高死亡率的疾病。內(nèi)皮細胞是血管內(nèi)膜的主要組成細胞,是保護血管的第一道重要屏障,內(nèi)膜異常是AS典型病理改變,表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞愈合能力降低、抗炎癥細胞浸潤能力下降以及細胞凋亡等,進而累及血管進一步損傷。人參皂苷Rg3(ginsenoside Rg3,Rg3)是人參的主要活性成分之一,其抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用已經(jīng)被熟知。隨著研究的不斷深入,Rg3對心血管系統(tǒng)的保護作用亦被證實,但有關Rg3抗AS作用及相關機制尚未明確。瑞舒伐他汀屬他汀類藥物,為HMG-Co A還原酶抑制劑,因具有比其他同類藥物調(diào)節(jié)血脂作用更強、半衰期更短以及生物利用度更高等優(yōu)點而備受青睞,但其抗AS機制及是否與內(nèi)皮保護作用有關尚需深入研究。本論文基于吉林省科技廳自然科學基金項目:“瑞舒伐他汀對ox-LDL導致內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的干預作用及分子機制研究”(編號:20150101200JC),探討瑞舒伐他汀在脂代謝異常引發(fā)AS中除降脂外的內(nèi)皮保護作用及機制,同時對比研究Rg3的內(nèi)皮保護和抗AS作用及機制。并通過體內(nèi)實驗比較瑞舒伐他汀、Rg3或二者聯(lián)用對ApoE~(-/-)小鼠AS的保護作用,以期為臨床不能耐受全劑量他汀類藥物或高肝酶活性患者,聯(lián)合應用瑞舒伐他汀和Rg3治療,確保更有效的冠狀動脈護理提供理論依據(jù)。主要研究如下:1.Rg3對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞功能異常的作用及機制研究為確定Rg3是否對ox-LDL導致內(nèi)皮細胞異常有改善作用,建立ox-LDL(200μg/mL)誘導的內(nèi)皮細胞(HUVECs)損傷模型,Rg3(15、30μmol/L)對HUVECs進行預處理,應用劃痕實驗、單核細胞黏附實驗和Western blotting等方法,研究Rg3對ox-LDL誘導HUVECs功能異常的影響。實驗結(jié)果顯示,Rg3可顯著對抗ox-LDL導致的HUVECs愈合能力及抗單核細胞黏附功能下降,減少FAK的磷酸化,抑制黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達,抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達,表明Rg3可抑制ox-LDL誘導HUVECs功能異常,且與抑制FAK介導的黏附因子表達有關。為闡明Rg3對ox-LDL誘導HUVECs功能異常的作用機制,采用了遷移實驗、單核細胞黏附實驗、Western blotting、免疫熒光和qPCR等方法和技術,對相關指標進行了檢測。實驗結(jié)果顯示,Rg3可顯著增強ox-LDL抑制HUVECs的PPARγ表達,抑制損傷的內(nèi)皮細胞內(nèi)NF-κB活化后核易位,降低炎癥因子MCP-1和IL-6 mRNA水平;給予GW9662(PPARγ特異性抑制劑)對HUVECs進行預處理,可顯著抑制Rg3增強HUVECs遷移及抗單核細胞黏附能力的作用,并抑制Rg3下調(diào)FAK的磷酸化、黏附因子和基質(zhì)金屬蛋白酶表達、NF-κB活化后核易位以及炎癥因子的作用,表明Rg3可能通過上調(diào)內(nèi)皮細胞PPARγ表達發(fā)揮抑制ox-LDL誘導HUVECs異常的作用。2.瑞舒伐他汀對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞凋亡的保護作用及機制研究建立ox-LDL誘導的內(nèi)皮細胞損傷模型,瑞舒伐他汀(0.01、0.1及1μmol/L)對HUVECs進行預處理,應用試劑盒、MTT、流式細胞術、DAPI染色和Western blotting等技術和方法,探究瑞舒伐他汀的抗AS作用是否與內(nèi)皮保護及抗內(nèi)皮凋亡有關。實驗結(jié)果顯示,瑞舒伐他汀可顯著增強ox-LDL刺激下HUVECs分泌NO水平降低,降低細胞氧化應激水平,增強HUVECs的PI3K/Akt/eNOS通路活化及Bcl-2/Bax的比率;MTT結(jié)果顯示,瑞舒伐他汀可抑制ox-LDL誘導的HUVECs生存率下降;流式細胞術檢測結(jié)果顯示,瑞舒伐他汀可顯著降低ox-LDL誘導的HUVECs凋亡率升高;DAPI染色結(jié)果顯示,瑞舒伐他汀可顯著抑制ox-LDL誘導的HUVECs細胞核損傷,以上均表明瑞舒伐他汀可以抑制ox-LDL誘導的HUVECs損傷及凋亡。此外,內(nèi)皮細胞因其含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),提示其可能對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激異常導致細胞凋亡更為敏感,為闡明瑞舒伐他汀抑制ox-LDL誘導HUVECs凋亡的作用機制,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關通路進行檢測,結(jié)果顯示瑞舒伐他汀顯著降低CHOP、sXBP1和Caspase-12mRNA水平,抑制GRP78表達,降低PERK、IRE1α及eIF2α的磷酸化,表明瑞舒伐他汀可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關通路來抑制ox-LDL誘導的HUVECs凋亡。3.Rg3與瑞舒伐他汀聯(lián)合應用對高脂飲食誘導ApoE~(-/-)小鼠動脈粥樣硬化作用研究為比較Rg3與瑞舒伐他汀的抗AS作用,探究Rg3與瑞舒伐他汀聯(lián)用是否可更有效抑制AS發(fā)生及發(fā)展,本研究采用高脂飼料(含40%脂肪,1.25%膽固醇)飼養(yǎng)ApoE~(-/-)小鼠成功復制動脈粥樣硬化模型后,隨機分為4組:模型組、Rg3組(Rg3)、瑞舒伐他汀組(RSV)和Rg3與瑞舒伐他汀聯(lián)用組(Rg3+RSV),以C57BL/6J小鼠保持喂養(yǎng)普通飼料作為正常對照。給藥4 w后,檢測小鼠血清T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C及CRP水平,HE染色和油紅O染色觀察小鼠主動脈AS斑塊情況,MASSON染色檢測小鼠主動脈膠原含量,免疫熒光染色檢測小鼠主動脈內(nèi)皮細胞凋亡情況,免疫組織化學染色檢測主動脈和斑塊巨噬細胞及平滑肌細胞含量,進而統(tǒng)計各組小鼠AS斑塊核帽比及易損指數(shù)。本研究結(jié)果表明,與正常對照組比較,模型組小鼠T-CHO、TG、LDL-C以及CRP水平均顯著升高,HDL-C水平顯著降低;主動脈內(nèi)膜及內(nèi)膜下細胞排列紊亂,大量胞質(zhì)呈空泡狀,且主動脈內(nèi)膜隆起纖維斑塊層,動脈壁炎細胞浸潤、泡沫化嚴重;主動脈內(nèi)皮細胞凋亡顯著增多,動脈壁膠原纖維含量顯著減少;主動脈及斑塊部位巨噬細胞表達顯著增多,平滑肌細胞顯著減少,小鼠AS斑塊核帽比及易損指數(shù)顯著升高。首先,與模型組比較,Rg3+RSV組及RSV組均顯著降低小鼠血清LDL-C水平,顯著抑制小鼠主動脈內(nèi)皮細胞凋亡,且兩組水平無顯著差異,同時Rg3+RSV組顯著降低小鼠血清T-CHO水平,但較正常仍呈較高水平,RSV組小鼠血清TG水平顯著下降,提示瑞舒伐他汀可能發(fā)揮主要降低小鼠血清脂蛋白及抗內(nèi)皮細胞凋亡作用;其次,Rg3+RSV組和Rg3組均顯著降低AS小鼠血清中CRP水平,兩組無顯著差異,提示Rg3可能發(fā)揮主要降低小鼠炎癥水平作用;另外,Rg3+RSV組和RSV組小鼠主動脈的膠原纖維含量較模型均顯著增加,Rg3+RSV組和Rg3組巨噬細胞表達較模型組減少更為顯著,而Rg3+RSV組α-SMA陽性表達增多顯著,使得Rg3+RSV組AS斑塊核帽比及易損指數(shù)降低更為顯著。綜上所述,Rg3可增強血管內(nèi)皮細胞愈合能力及抵御炎癥細胞黏附的能力,降低炎癥因子和促AS細胞因子水平,可能與調(diào)節(jié)PPARγ/FAK信號通路有關,且Rg3可降低AS小鼠炎癥水平,降低主動脈內(nèi)膜及AS斑塊巨噬細胞浸潤,表明其可能通過抑制炎癥對內(nèi)皮損傷發(fā)揮抗AS作用;瑞舒伐他汀除改善AS小鼠血脂水平外,具有抑制AS小鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡作用,可能與增強血管內(nèi)皮細胞PI3K/Akt/eNOS通路活化以及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關通路有關;另外,Rg3顯示出顯著抑制ApoE~(-/-)小鼠的AS發(fā)生發(fā)展的作用,且Rg3與瑞舒伐他汀聯(lián)用抗AS效果更為顯著,提示當臨床應用他汀類藥物治療AS效果不理想或?qū)λ☆愃幬锊荒褪軙r,聯(lián)合應用Rg3可能更有效發(fā)揮治療AS作用。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R965
【文章目錄】：
中文摘要
abstract
英文縮寫詞表
第一章 文獻綜述
    1.氧化型低密度脂蛋白與動脈粥樣硬化
        1.1 氧化型低密度脂蛋白與動脈粥樣硬化關系
        1.2 氧化型低密度脂蛋白對血管內(nèi)皮細胞的影響
            1.2.1 氧化型低密度脂蛋白與內(nèi)皮功能異常
            1.2.2 氧化型低密度脂蛋白促內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與內(nèi)皮細胞凋亡
        1.3 氧化型低密度脂蛋白對血管炎癥細胞的影響
        1.4 氧化型低密度脂蛋白對血管平滑肌細胞的影響
    2.抗動脈粥樣硬化藥物研究進展
        2.1 他汀類藥物在抗動脈粥樣硬化治療中的應用
        2.2 人參皂苷Rg3抗動脈粥樣硬化作用研究進展
        2.3 藥物聯(lián)合應用治療動脈粥樣硬化
第二章 人參皂苷Rg3對ox-LDL誘導內(nèi)皮功能異常的作用及機制研究
    1.實驗材料
        1.1 藥品及試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 主要溶液及配制
    2.實驗方法
        2.1 HUVECs的培養(yǎng)、傳代和凍存
        2.2 THP-1的培養(yǎng)、傳代和凍存
        2.3 Ox-LDL損傷HUVECs最佳濃度的確定
        2.4 Rg3對HUVECs生存率的影響
        2.5 Rg3對ox-LDL損傷HUVECs生存率的作用
        2.6 劃痕實驗
        2.7 THP-1細胞黏附實驗
        2.8 Transwell實驗
        2.9 免疫熒光檢測
        2.10 qPCR檢測炎癥因子表達的影響
        2.11 Western Blot
        2.12 統(tǒng)計學處理
    3.實驗結(jié)果
        3.1 Ox-LDL損傷HUVECs最佳濃度
        3.2 Rg3對HUVECs生存率的影響
        3.3 Rg3對ox-LDL降低HUVECs細胞生存率的作用
        3.4 Rg3對ox-LDL損傷HUVECs愈合能力的改善作用
        3.5 Rg3對ox-LDL誘導THP-1對HUVECs黏附的抑制作用
        3.6 Rg3對ox-LDL誘導HUVECs黏附分子ICAM-1、VCAM-1表達的影響
        3.7 Rg3對ox-LDL誘導HUVECs FAK磷酸化的影響
        3.8 Rg3對ox-LDL誘導HUVECs內(nèi)MMP-2及MMP-9表達的影響
        3.9 Rg3對ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表達的影響
        3.10 GW9662抑制PPARγ表達的濃度確定
        3.11 GW9662和Rg3對ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表達的作用
        3.12 GW9662和Rg3對ox-LDL導致HUVECs遷移抑制、THP-1黏附及相關信號通路的作用
    4.小結(jié)
第三章 瑞舒伐他汀對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞凋亡的保護作用及機制研究
    1.實驗材料
        1.1 藥品及試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 主要溶液配制
    2.實驗方法
        2.1 瑞舒伐他汀對HUVECs生存率的影響
        2.2 瑞舒伐他汀對ox-LDL損傷HUVECs生存率的作用
        2.3 試劑盒檢測NO和氧化應激水平
        2.4 Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡
        2.5 DAPI染色
        2.6 qPCR檢測
        2.7 Western Blot
        2.8 統(tǒng)計學處理
    3.實驗結(jié)果
        3.1 瑞舒伐他汀對HUVECs生存率的影響
        3.2 瑞舒伐他汀對ox-LDL導致HUVECs損傷的改善作用
        3.3 瑞舒伐他汀對ox-LDL抑制HUVECs NO分泌的影響
        3.4 瑞舒伐他汀對ox-LDL誘導HUVECs氧化應激的影響
        3.5 瑞舒伐他汀對ox-LDL抑制HUVECse NOS磷酸化的影響
        3.6 瑞舒伐他汀對ox-LDL抑制HUVECs PI3K/Akt磷酸化的影響
        3.7 瑞舒伐他汀對各組細胞Bcl-2/Bax表達的影響
        3.8 瑞舒伐他汀對ox-LDL誘導HUVECs凋亡的影響
        3.9 瑞舒伐他汀對各組HUVECs內(nèi)CHOP、sXBP1及Caspase-12 mRNA水平的影響
        3.10 瑞舒伐他汀對ox-LDL誘導的HUVECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響
    4.小結(jié)
-/-小鼠動脈粥樣硬化作用研究'>第四章 人參皂苷Rg3與瑞舒伐他汀聯(lián)合應用對高脂飲食誘導的ApoE^-/-小鼠動脈粥樣硬化作用研究
    1.實驗材料
        1.1 藥品及試劑
        1.2 實驗儀器
        1.3 主要溶液配制
    2.實驗方法
        2.1 實驗動物
        2.2 動物的飼養(yǎng)
        2.3 動脈粥樣硬化模型復制及給藥
        2.4 血脂四項指標檢測
        2.5 Elisa試劑盒檢測小鼠血清CRP水平
        2.6 小鼠主動脈分離及主動脈大體油紅O染色
        2.7 HE及MASSON染色
        2.8 免疫組織化學及免疫熒光染色
        2.9 統(tǒng)計學處理
    3.實驗結(jié)果
        3.1 藥物對AS小鼠體重及一般狀態(tài)的影響
        3.2 藥物對AS斑塊水平對影響
        3.3 藥物對AS小鼠血清脂蛋白水平的影響
        3.4 藥物對AS小鼠血清CRP水平的影響
        3.5 藥物對AS小鼠主動脈內(nèi)皮細胞凋亡的影響
        3.6 藥物對AS小鼠主動脈纖維斑塊層及膠原纖維水平的影響
        3.7 藥物對AS小鼠主動脈CD68及α-SMA表達的影響
    4.小結(jié)
第五章 討論
    1.體外實驗研究
        1.1 Rg3對ox-LDL誘導內(nèi)皮功能異常的作用及機制研究
        1.2 瑞舒伐他汀對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞凋亡的保護作用及機制研究
    2.體內(nèi)實驗研究
        2.1 Rg3與瑞舒伐他汀聯(lián)用對AS小鼠血清脂蛋白水平的影響
        2.2 Rg3與瑞舒伐他汀聯(lián)用對AS小鼠血清CRP水平的影響
-/-小鼠AS病理改變的影響'>        2.3 Rg3與瑞舒伐他汀聯(lián)用對ApoE^-/-小鼠AS病理改變的影響
結(jié)論及創(chuàng)新點
工作展望
參考文獻
作者簡介及在學期間所取得科研成果
致謝

【參考文獻】

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本文編號：2893347