半夏瀉心湯方出自《傷寒雜病論》,具有寒熱平調(diào)、消痞散結(jié)、辛開苦降、補瀉同施、化痰行瘀功效。前期研究表明半夏瀉心湯具有抑制體外胰島β細胞凋亡、促進胰島素分泌的作用,但具體機制有待進一步探索。本實驗結(jié)合體內(nèi)體外實驗,進一步證實半夏瀉心湯對胰島細胞的保護作用,并探索其作用機制。目的:通過體內(nèi)實驗(糖尿病(Diabetes mellitus,DM)小鼠)與體外實驗(MIN6細胞)相結(jié)合,觀察半夏瀉心湯(Banxia Xiexin Decoction,BX)對高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導的DM小鼠胰島細胞以及過氧叔丁醇(t-butylhydroperoxide,TBHP)誘導的MIN6細胞損傷的保護作用。探討半夏瀉心湯對DM小鼠胰島細胞以及MIN6胰島細胞的保護作用機制。方法:1.動物實驗:8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠隨機分為6組。高脂飼料飼喂8周后腹腔注射STZ 55mg/kg,持續(xù)注射3天進行造模。實驗共分為6組:正常組(Con)、模型組(Mod)、二甲雙胍組(MET)、半夏瀉心湯低劑量組(BXL)、半夏瀉心湯中劑量組(BXM)、半夏瀉心湯高劑量組(BXH)。連續(xù)灌胃7周,每2周監(jiān)測體重,于給藥第0周、3周、7周測量小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)。7 周后取血,檢測糖化血紅蛋白(Hemoglobin A1C,HbA1c)、空腹胰島素(fasting insulin,FINS)及血脂四項(TC、TG、HDL-C、LDL-C),并取胰腺置于-80℃保存?zhèn)溆�。各組小鼠干預7周末測定FBG后,予2g/kg葡萄糖溶液灌胃,分別于糖負荷后30min、60min、120min測定血糖值,根據(jù)各時間點血糖值繪制口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)曲線,并計算血糖曲線下面積(Area under the curve,AUC)。進行胰腺HE染色,原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)檢測胰島細胞凋亡率、試劑盒檢測胰腺組織勻漿MDA、SOD的含量,Western blot法檢測PI3K/AKT/FOXO1信號通路及相關(guān)蛋白的表達。2.細胞實驗:取對數(shù)生長期MIN6細胞,0.25%胰酶消化后加入高糖DMEM培養(yǎng)液,PBS吹打并制成單細胞懸液并接種于96孔板,每孔加入100μL單細胞懸液后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后,加入不同濃度的半夏瀉心湯(0.1、0.5、1、1.5、2.5、5、10mg/ml)孵育12h后進行MTT實驗,酶標儀檢測OD值,并計算細胞活力以確定半夏瀉心湯的濃度范圍。細胞貼壁生長后加入半夏瀉心湯(0.25、0.5、1mg/ml)預處理細胞12h,藥物孵育結(jié)束后加入100μM的TBHP孵育2h。TBHP處理結(jié)束后棄去孔內(nèi)液體進行MTT實驗,用酶標儀檢測OD值,以篩選半夏瀉心湯的最終孵育濃度。實驗分為以下5組:對照組(Con,DMEM高糖培養(yǎng)液)、模型組(Mod,DMEM高糖培養(yǎng)液+TBHP)、半夏瀉心湯組(BX,DMEM高糖培養(yǎng)液+TBHP+0.5mg/ml的半夏瀉心湯)、半夏瀉心湯+抑制劑組(BX+LY,DMEM 高糖培養(yǎng)液+TBHP+0.5mg/ml 的半夏瀉心湯+LY294002(100μM))、抑制劑組(LY,DMEM 高糖培養(yǎng)液+TBHP+LY294002(100μM))。Hoechst 33342法與TUNEL法檢測半夏瀉心湯對TBHP誘導的細胞凋亡的影響。并進行葡萄糖刺激的胰島素分泌實驗(GSIS實驗),采用ELISA法分別檢測胰島素水平。DCFH-DA探針檢測細胞內(nèi)ROS含量,試劑盒檢測細胞內(nèi)MDA、SOD、GSH-Px含量。Western blot法檢測PI3K/AKT/FOXO1信號通路及相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果:1.動物實驗:(1)半夏瀉心湯對各組小鼠體重的影響:小鼠自造模成功始,模型組小鼠體重低于其他各組。對照組小鼠體重逐漸增加。至第7周灌胃結(jié)束后,對照組小鼠體重明顯大于模型組(P0.05)和各藥物干預組(P0.05);模型組小鼠與各藥物干預組小鼠之間體重無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)半夏瀉心湯對各組小鼠糖脂代謝的影響:造模成功后,模型組、二甲雙胍組、半夏瀉心湯組血糖水平均顯著高于對照組(P0.05)。灌胃第3周及第7周后,模型組血糖顯著高于對照組血糖(P0.05);與模型組相比,二甲雙胍組、半夏瀉心湯組血糖水平顯著低于模型組(P0.05)。與對照組相比,模型組小鼠糖化血紅蛋白含量、TC、TG、LDL含量均顯著增加(P0.05),HDL含量顯著下降(P0.05);與模型組相比,二甲雙胍組、半夏瀉心湯組糖化血紅蛋白含量、TC、TG含量均有明顯下降(P0.05),HDL含量顯著增加(P0.05)。(4)半夏瀉心湯對各組小鼠胰島素分泌及HOMA-β指數(shù)的影響:與對照組相比,模型組小鼠空腹胰島素水平及HOMA-β指數(shù)顯著下降(P0.05);與模型組相比,二甲雙胍組、半夏瀉心湯組空腹胰島素水平及HOMA-β指數(shù)均有明顯提高。(5)半夏瀉心湯對各組小鼠葡萄糖耐量及AUCOGTT的影響:與對照組相比,模型組小鼠在灌胃葡萄糖前后各時間點血糖水平均顯著升高(P0.05)。OGTT Omin時,與模型組相比,二甲雙狐組、半夏瀉心湯組小鼠血糖水平均有顯著下降(P0.05)。OGTT 30min時,各組小鼠血糖水平均顯著升高。OGTT 60min時,與模型組相比,二甲雙胍組、半夏瀉心湯組小鼠血糖水平開始顯著下降(P0.05)。OGTT 120min時,與模型組相比,二甲雙胍組、半夏瀉心湯組小鼠血糖水平均有顯著下降(P0.05)。與對照組相比,模型組小鼠AUCOGTT顯著增加(P0.05);與模型組相比,二甲雙胍組、半夏瀉心湯組小鼠AUCOGTT均有顯著下降(P0.05)。(6)半夏瀉心湯對各組小鼠胰腺形態(tài)的影響(HE染色法):正常小鼠胰腺組織的胰島為圓形或橢圓形的細胞團,胞團大小不一,結(jié)構(gòu)完整、規(guī)則、邊緣清晰,散布于胰腺腺泡之間,細胞團數(shù)量較多,胰島內(nèi)β細胞豐富、大小均勻、飽滿充盈、排列緊密;而模型組小鼠胰島細胞團數(shù)量減少,胰島面積萎縮、形態(tài)各異不規(guī)整、胰島邊緣不清、結(jié)構(gòu)紊亂,胰島內(nèi)β細胞腫脹、變形,細胞質(zhì)染色變淺或呈空泡化現(xiàn)象,核固縮或核缺失現(xiàn)象明顯,且部分胰腺外分泌腺腺泡深入胰島內(nèi)部;與模型組小鼠相比,各藥物干預組小鼠胰島及胰島內(nèi)細胞數(shù)目增加,形態(tài)結(jié)構(gòu)有所改善。(7)半夏瀉心湯對各組小鼠胰島B細胞凋亡的影響:與對照組相比,模型組小鼠細胞凋亡率顯著增加(P0.05);與模型組相比,二甲雙胍組、半夏瀉心湯組細胞凋亡率均有明顯下降(P0.05)。(8)半夏瀉心湯對各組小鼠氧化應激指標的影響:與對照組相比,模型組小鼠MDA含量顯著增加(P0.05),SOD含量顯著降低(P0.05);與模型組相比,二甲雙胍組、半夏瀉心湯組MDA含量明顯下降(P0.05);SOD含量明顯提高(P0.05)。(9)半夏瀉心湯對各組小鼠PI3K/AKT/FOXO1信號通路及相關(guān)蛋白表達的影響:與對照組相比,模型組 p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1、Pdx-1/β-actin、MafA/β-actin 比值均明顯下降(P0.05);Caspase-3/β-actin、Bax/β-actin、P27/β-actin比值均明顯增加(P0.05)。與模型組相比,二甲雙胍組、半夏瀉心湯劑量組 p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1、Pdx-1/β-actin、MafA/β-actin 比值均顯著提高(P0.05);Caspase-3/β-actin、Bax/β-actin、P27/β-actin 比值顯著下降(P0.05)。2.細胞實驗:(1)半夏瀉心湯對MIN6細胞毒性的影響:當半夏瀉心湯濃度≥2.5 mg/ml時,MIN6細胞活力顯著下降。因此,后續(xù)實驗選擇0.25、0.5、1.0 mg/ml 3個濃度進行。(2)半夏瀉心湯對TBHP誘導的MIN6細胞增殖抑制的影響:與對照組相比,模型組細胞活力顯著下降(P0.05)。與模型組相比BX0.5劑量組和BX1.0劑量組細胞活力顯著增加(P0.05),BX0.5劑量組和BX1.0劑量組間無顯著差異(P0.05),但BX0.5劑量組細胞活力略高,故最終選擇半夏瀉心湯0.5 mg/ml劑量組為半夏瀉心湯藥物干預組。(3)半夏瀉心湯對TBHP誘導的MIN6細胞凋亡的影響:Hoechst 33342染色顯示對照組細胞完整,其細胞核均勻染色。在TBHP刺激后,細胞不規(guī)則地固縮并聚集,顯示出致密的濃染,細胞核分裂成碎片。與模型組相比,半夏瀉心湯組核固縮、致密濃染和細胞碎片減少,細胞形態(tài)有所改善。與對照組相比,模型組細胞凋亡率顯著增加(P0.05)。與模型組相比,半夏瀉心湯預處理12h可顯著降低細胞凋亡率(P0.05)。(4)半夏瀉心湯對葡萄糖刺激的胰島素的分泌的影響:模型組MIN6細胞的功能受損,與2.8mM模型組相比,16.7mM模型組的葡萄糖刺激的胰島素分泌未見明顯增加(P0.05)。而半夏瀉心湯預處理12h后16.7mM半夏瀉心湯組的葡萄糖刺激的胰島素分泌明顯增加,改善了胰島細胞的功能(P0.05)。(5)半夏瀉心湯對各組細胞氧化應激指標的影響:與對照組相比,模型組細胞內(nèi)ROS及MDA含量顯著增加(P0.05);SOD及GSH-Px含量顯著降低(P0.05)。與模型組相比半夏瀉心湯組細胞內(nèi)ROS及MDA含量顯著減少(P0.05);SOD 及 GSH-Px 含量顯著增加(P0.05)。(6)半夏瀉心湯對PI3K/AKT/FOXO1信號通路及相關(guān)蛋白表達的影響:與對照組相比,模型組p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1、Pdx-1/β-actin 比值均明顯下降(P0.05);Caspase-3/β-actin、Bax/β-actin、P27/β-actin 比值均明顯增加(P0.05)。與模型組相比半夏瀉心湯組p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1、Pdx-1/β-actin 比值顯著提高(P0.05);Caspase-3/β-actin、Bax/β-actin、P27/β-actin 比值顯著下降(P0.05)。而加入PI3K抑制劑后半夏瀉心湯提高p-AKT/AKT 比值表達的作用被抵消。結(jié)論:1.半夏瀉心湯具有顯著改善DM小鼠糖脂代謝、胰島功能、胰腺組織結(jié)構(gòu)損害的作用,可明顯抑制胰島β細胞凋亡、促進胰島素分泌。2.半夏瀉心湯具有抑制MIN6細胞凋亡、促進胰島素分泌、保護MIN6細胞的作用。3.半夏瀉心湯對DM小鼠胰島細胞和MIN6細胞的保護作用可能是通過抑制氧化應激、增強機體抗氧化能力;激活PI3K/AKT/FOXO1信號通路,并產(chǎn)生級聯(lián)反應,影響下游Caspase-3、Bax、P27、MafA和Pdx-1蛋白的表達有關(guān)。創(chuàng)新點:1.本研究證明半夏瀉心湯可改善DM小鼠和MIN6胰島β細胞凋亡、促進胰島素分泌,保護胰島細胞,為半夏瀉心湯的臨床應用提供了實驗依據(jù)。2.通過體內(nèi)與體外實驗相結(jié)合,證實半夏瀉心湯是通過減輕氧化應激損傷、增強機體抗氧化能力;激活PI3K/AKT/FOXO1信號通路,并產(chǎn)生級聯(lián)反應,影響下游Caspase-3、Bax、P27、MafA和Pdx-1蛋白的表達發(fā)揮保護胰島細胞的作用。
【學位單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

?中國中醫(yī)科學院二〇一七級博士研究生學位論文???４．實驗結(jié)果??４．?１半夏瀉心湯對各組小鼠一般狀態(tài)及體重的影響??正常組小鼠精神狀態(tài)良好、毛發(fā)光澤，活動度正常，飲食、飲水、尿量均正??常對外界刺激反應靈敏；模型組小鼠毛色枯槁、晦暗，多飲、多食、多尿，行動??遲緩，精神遲滯，易驚易躁，或?qū)ν饨绱碳し磻t純。給藥干預后小鼠精神狀態(tài)、??活動度、毛色等有所改善。小鼠自造模成功開始，模型組小鼠始終體重低于其他??各組。對照組小鼠體重穩(wěn)步增加。至第７周灌胃結(jié)束后，對照組小鼠體重明顯大??于模型組（ＰＣＯ．?０５）和各藥物干預組（Ｐ＞０．?０５）；模型組小鼠與各藥物干預組??小鼠之間體重無統(tǒng)計學差異（尸＞０．０５）。（圖１）??２６－｜??２４－??§２２?』??１?＾?十?ＭＥＴ??１８＇?ＢＸＬ??ＢＸＭ??分ＢＸＨ??１６Ｈ?！?１?１?１??０?２?４?６?７?８??Ｔｉｍｅ（Ｗ）??圖１半夏瀉心湯對各組小鼠體重的影響??注：Ｃｏｎ：對照組、Ｍｏｄ：模型組、ＭＥＴ：二甲雙胍組、ＢＸＬ：半夏瀉心湯低劑量組、ＢＸＭ：??半夏瀉心湯中劑量組、ＢＸＨ：半夏瀉心湯高劑量組。林戶＜０．０１?ｖｅｒｓｕｓ?Ｃｏｎ，?＊戶＜０．０５?ｖｅｒｓｕｓ??Ｃｏｎ〇??４．?２半夏瀉心湯對各組小鼠肝體比和胰體比的影響??與對照組相比，模型組肝體比比值顯著增加（戶＜０．?０５）；與模型組相比，二??甲雙胍組、半夏瀉心湯低、中、高劑量組肝體比比值均有明顯下降（戶＜０．?０５）；??６４??

?半夏瀉心湯對糖尿病胰島細胞的保護作用與機制研究???但二甲雙胍組、半夏瀉心湯低、中、高劑量組各組之間無統(tǒng)計學差異（戶＞０．?０５）??（圖?２Ａ、表?１０）。??各組之間胰體比比值均無明顯差異（尸＞０．０５）（圖２Ｂ、表１０）。??１０】?０．８－Ｉ??Ｍｉｌｌ??＃?ｚ?ｚ＃次礦??圖２半夏瀉心湯對各組小鼠肝體比和胰體比的影響??（Ａ）半夏瀉心湯對各組小鼠肝體比比值的影響：（Ｂ）半夏瀉心湯對各組小鼠胰體比比值??的影響。注：Ｃｏｎ：對照組、Ｍｏｄ：模型組、ＭＥＴ：二甲雙胍組、ＢＸＬ：半夏瀉心湯低劑量??組、ＢＸＭ：半夏瀉心湯中劑量組、ＢＸＨ：半夏瀉心湯高劑量組。＊＊戶＜０．０１?ｖｅｒｓｕｓ?Ｃｏｎ，??＊戶＜０．?０５?ｖｅｒｓｕｓ?Ｃｏｎ；?＃＃?／Ｘ０．?０１?ｖｅｒｓｕｓ?Ｍｏｄ，＃戶＜０．?０５?ｖｅｒｓｕｓ?Ｍｏｄ。???表１（＞半夏瀉心湯對各組小鼠肝體比和胰體比的影響???一?組別?肝體比（％）?胰體比（％）??Ｃｏｎ?４．７８?士０．１３?０．５４土?０．０２??Ｍｏｄ?７．３１±０＿２４Ｍ?０．４７±０．０２??ＭＥＴ?５．２９±０．２９＃＃?０．４７±０．０３??ＢＸＬ?６．１２±０．２４＃?０．４９±０．０３??ＢＸＭ?５．９７±０．３０＃＃?０．４８±０．０４??ＢＸＨ?５．４０±０．１６＃＃?０．４１±０．０３??注：Ｃｏｎ：對照組、Ｍｏｄ：模型組、ＭＥＴ：二甲雙胍組、ＢＸＬ：半夏瀉心湯低劑量組、ＢＸＭ：??半夏瀉心湯中劑量組、ＢＸＨ：半夏瀉心湯高劑量組。林戶＜０．０１?ｖｅｒｓｕｓ?Ｃｏｎ，?０５?ｖｅｒｓｕｓ??Ｃｏｎ；?＃＃?

?中國中醫(yī)科學院二〇一七級博士研究生學位論文???與模型組相比，二甲雙胍組、半夏瀉心湯中、高劑量組血糖水平顯著低于模型組??（尸＜０．０５）；而半夏瀉心湯低劑量組與模型組間無顯著性差異（Ｐ＞０．?０５）；且??二甲雙胍組、半夏瀉心湯中、高劑量組間無顯著性差異（Ｐ＞０．?０５）（圖３Ｃ、表??１１）。??各組小鼠不同時間點血糖折線圖見圖３Ｄ、表１１。??ｉＬｉｉｆｉ?ｉｔｉｉｉ??Ｃｏｎ?Ｍｏｄ?Ｍｋｌ?ＢＸＬ?ｂＩｍ?Ｂ＾Ｈ?Ｃｏｎ?Ｍｏｄ?ＭＥＴ?ＢＸＬ?ＢＸＭ?ＢＸＨ??０周血糖?３周麵??３０－ｉ??＊？?３０１??ｆＳｊ?＾?工Ｃｏｎ??５－?２０－?卜?＃＃?ｍ?ｉ?－??ｉ??—ｆ?Ｍｏｄ??ＩＪ?ＩＩ?ｌｉｉ?—??ｃ￡?Ｄ?ｒ＊＾：?＊?＝??Ｃｏｎ?Ｍｏｄ?ＭＥＴ?ＢＸＬ?ＢＸＭ?ＢＸＨ?。??????７?周血糖?＾￣￣１＂＂２￣￣３＂＂４５６７８??Ｔｉｍｅ?（Ｗ）??圖３半夏瀉心湯對各組小鼠空腹血糖水平的影響??（Ａ）半夏瀉心湯對各組小鼠０周空腹血糖水平的影響：（Ｂ）半夏瀉心湯對各組小鼠３周??空腹血糖水平的影響；（Ｃ）半夏瀉心湯對各組小鼠７周空腹血糖水平的影響；（Ｄ）各組??小鼠不同時間點血糖折線圖。注：Ｃｏｎ：對照組、Ｍｏｄ：模型組、ＭＥＴ：二甲雙胍組、ＢＸＬ：??半夏瀉心湯低劑量組、ＢＸＭ：半夏瀉心湯中劑量組、ＢＸＨ：半夏瀉心湯高劑量組。＊＊＇＜０．?０１??ｖｅｒｓｕｓ?Ｃｏｎ，氺／＾。．?０５?ｖｅｒｓｕｓ?Ｃｏｎ；?＃＃／■＜０？?０１?ｖｅｒｓｕｓ?Ｍｏｄ，?＃／＊＜０．?０５?ｖｅｒｓｕｓ?Ｍｏｄ
【參考文獻】

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本文編號：2892891