目的:在法醫(yī)物證學(xué)研究中,混合生物檢材一直是檢驗的難點(diǎn),因為其組成人數(shù)和各組成成分比例的不確定性,造成混合斑的解釋困難,使得證據(jù)不能發(fā)揮原本的效力。目前常規(guī)檢測的生物標(biāo)記是短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat,STR),包括常染色體STR和Y染色體STR標(biāo)記。對于混合斑STR分型結(jié)果的解析,也發(fā)展了基于峰高、峰面積等似然比法、貝葉斯理論的統(tǒng)計學(xué)方法等,但不同的方法解析標(biāo)準(zhǔn)不一樣。而且,由于遮蓋效應(yīng)(Masking effect),傳統(tǒng)STR標(biāo)記只能檢測出混合比例在1:10以上的混合斑中的次要參與者,如果混合比例在1:10以下,則無法獲得次要參與者的分型。近年來,法醫(yī)學(xué)者發(fā)展了更多的遺傳標(biāo)記,例如單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(Single nucleotide polymorphism,SNP)、插入缺失位點(diǎn)(insertion-Deletion polymorphism,INDEL/DIP)、微單倍型標(biāo)記(Microhaplotype),極大的提高鑒定混合斑的靈敏度,但由于SNP、DIP和微單倍型位點(diǎn)由于其多態(tài)性較低,目前只能作為補(bǔ)充檢測。2013年,Hall D等學(xué)者提出了一種聯(lián)合標(biāo)記DIP-STR,將DIP位點(diǎn)的高靈敏度和STR基因座的高多態(tài)性結(jié)合,用于檢測不平衡混合斑。Zhang L等學(xué)者提出利用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(Amplification refractory mutation system,ARMS)原理,實(shí)現(xiàn)SNP-STR的聯(lián)合標(biāo)記檢測,并將其應(yīng)用于不平衡混合斑。綜合以上生物標(biāo)記的優(yōu)勢,我們提出了運(yùn)用DIP-SNP和DIP-Microhaplotype遺傳標(biāo)記檢測不平衡混合斑和降解的不平衡混合斑。建立利用等位基因特異性引物復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)、SNaPshot微測序技術(shù)和毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis,CE)技術(shù)的復(fù)合體系,并探索了這兩類聯(lián)合遺傳標(biāo)記在不平衡混合斑和降解不平衡混合斑的應(yīng)用。方法:1、建立基于DIP-SNP遺傳標(biāo)記對不平衡混合斑的分析方法:(1)按照以下標(biāo)準(zhǔn),在數(shù)據(jù)庫中篩選DIP-SNP遺傳標(biāo)記:1)DIP位點(diǎn)的等位基因長度(插入或者缺失的堿基)介于2bp-10bp之間;2)DIP位點(diǎn)不能位于重復(fù)區(qū);3)DIP和SNP位點(diǎn)的雜合度≥0.2;4)DIP和SNP位點(diǎn)距離≤300bp。(2)根據(jù)等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù),利用Primer 3軟件設(shè)計L型、S型上游引物和下游引物。(3)構(gòu)建L型和S型復(fù)合擴(kuò)增體系。(4)設(shè)計單堿基延伸引物,構(gòu)建SNaPshot微測序體系和電泳檢測方法。(5)利用60例山西漢族健康無關(guān)個體,調(diào)查人群數(shù)據(jù)。(6)檢測復(fù)合體系的靈敏度和種屬特異性。(7)檢測單個基因座對二參與者不平衡混合斑的檢測靈敏度和復(fù)合體系對二參與者不平衡混合斑的檢測靈敏度。2、建立基于DIP-SNP遺傳標(biāo)記對不平衡混合斑和降解不平衡混合斑的分析方法:(1)按照以下標(biāo)準(zhǔn),在數(shù)據(jù)庫中篩選新的DIP-SNP遺傳標(biāo)記:1)SNP位點(diǎn)位于DIP位點(diǎn)的上下游150bp以內(nèi);2)avHET≥0.2;3)DIP-SNP遺傳標(biāo)記位于不同染色體。(2)根據(jù)等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù),利用Primer 3軟件設(shè)計L型、S型上游引物和下游引物。(3)構(gòu)建L型和S型復(fù)合擴(kuò)增體系。(4)設(shè)計單堿基延伸引物,構(gòu)建SNaPshot微測序體系和電泳檢測方法。(5)利用60例山西漢族健康無關(guān)個體,調(diào)查人群數(shù)據(jù)。(6)檢測復(fù)合體系的靈敏度和種屬特異性。(7)檢測單個基因座對二參與者不平衡混合斑的檢測靈敏度和復(fù)合體系對二參與者不平衡混合斑、二參與者降解不平衡混合斑的檢測靈敏度。3、建立基于DIP-Microhaplotype遺傳標(biāo)記對不平衡混合斑和降解檢材的分析方法:(1)按照以下標(biāo)準(zhǔn),在數(shù)據(jù)庫中篩選DIP-Microhaplotype遺傳標(biāo)記:1)Microhaplotype位點(diǎn)位于DIP位點(diǎn)上游或者下游150bp以內(nèi);3)DIP和SNPs的avHET≥0.2;4)DIP-Microhaplotype遺傳標(biāo)記位于不同染色體。(2)根據(jù)等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù),利用Primer 3軟件設(shè)計L型、S型上游引物和下游引物。(3)構(gòu)建L型和S型復(fù)合擴(kuò)增體系。(4)設(shè)計單堿基延伸引物,構(gòu)建SNaPshot微測序體系和電泳檢測方法。(5)利用60例山西漢族健康無關(guān)個體,調(diào)查人群數(shù)據(jù)。(6)檢測復(fù)合體系的靈敏度和種屬特異性。(7)評估單個基因座對二參與者不平衡混合斑的檢測靈敏度和復(fù)合體系對單一降解檢材、二參與者不平衡混合斑的檢測靈敏度。(8)對10000對二參與者模擬混合斑進(jìn)行44個基因座的分析。結(jié)果:1、我們共建立了2個DIP-SNP體系,分別包含有14個和20個DIP-SNP遺傳標(biāo)記,其中有3個基因座在山西人群中無多態(tài)性。其余基因座多態(tài)性良好,分布符合Hardy-Weinberg平衡。兩個體系的累計個人識別概率分別為0.999882971和0.998363862。對混合斑檢測的平均有效性標(biāo)記值為0.301和0.293。兩個復(fù)合體系可以檢測到1ng以上DNA模板。復(fù)合體系在檢測二參與者混合斑中的次要參與者時,靈敏度分別為1:50和1:100。單個基因座對二參與者混合斑中的次要參與者進(jìn)行檢測時,靈敏度均為1:1000。2、該10個DIP-Microhaplotype遺傳標(biāo)記在山西漢族人群中多態(tài)性良好,分布符合Hardy-Weinberg平衡。該系統(tǒng)的累計個人識別概率為0.998805889。具有種屬特異性。DIP-SNP遺傳標(biāo)記的表型個數(shù)從2到4個。其中有1個基因座的DIP位點(diǎn)無多態(tài)性,其余9個基因座對混合斑檢測的平均有效性標(biāo)記值(Informative marker value,I value)為0.308。使用0.1ngDNA模板即可獲得目標(biāo)峰,但是為了得到更可信的峰,我們推薦使用1-10ngDNA模板。對二參與者混合斑中次要參與者獨(dú)有的單倍型的檢測靈敏度為1:100。單個基因座對二參與者混合斑中次要參與者的檢測靈敏度為1:1000。通過對10000對模擬混合斑的44個基因座分析,有效性標(biāo)記的個數(shù)為3-24個,平均為13.5個,有效性標(biāo)記越多,檢測到的次要參與者的單倍型越多,對次要參與者的個人識別力越高。結(jié)論:本實(shí)驗成功構(gòu)建了2個DIP-SNP復(fù)合體系和1個DIP-Microhaplotype復(fù)合體系,并驗證了其在單一降解檢材、不平衡混合斑、降解的不平衡混合斑的應(yīng)用價值。DIP-SNP和DIP-Microhaplotype兩類遺傳標(biāo)記可作為法醫(yī)DNA混合斑檢測時的一種補(bǔ)充工具。未來需要篩選更多這樣的遺傳標(biāo)記。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：D919.2
【部分圖文】：

DIP-SNP的命名原則

其中,L型是指插入型(Long),S型是指缺失型(Short)。L型上游引物中“.”后面的序列即為插入缺失序列,S型上游引物中“.”后為遞補(bǔ)上來的堿基。引物設(shè)計原理圖見圖1-2。PCR引物設(shè)計參數(shù):

利用DIP-SNP遺傳標(biāo)記進(jìn)行混合斑中次要參與者的鑒定時,只有當(dāng)次要參與者擁有了一條或者兩條獨(dú)有的,和主要參與者不同的DIP等位基因時,利用我們設(shè)計的等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù),可以將次要參與者特有的單倍型挑選出來。如圖1-3所示,在兩種情況下,利用DIP-SNP遺傳標(biāo)記可將二參與者混合斑中的次要參與者區(qū)分出來。第一,兩個參與者的DIP分型為不同的純合子時(圖中黃色方格);第二,次要參與者的DIP分型為雜合子,主要參與者為純合子時(圖中藍(lán)色方格)。其余情況下是不能將二者區(qū)分開的。那么一個DIP-SNP遺傳標(biāo)記能作為有效性標(biāo)記的能力為I=2l2s2+2l3s+2ls3,其中l(wèi)為DIP位點(diǎn)插入的頻率,s為DIP位點(diǎn)缺失的頻率[28,29]。我們用I值(Informative value)來評估每個DIP-SNP對二參與者混合斑的鑒別能力。(1)單個基因座對混合斑中次要參與者的檢測靈敏度
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本文編號：2888294