核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)誘導(dǎo)表達(dá)的基因廣泛參與各種生命活動(dòng),在免疫應(yīng)答中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。NF-κB過度活化可以直接引起組織損傷、自身免疫性疾病以及炎癥相關(guān)的癌癥。因此,NF-κB信號(hào)通路的嚴(yán)密調(diào)控對(duì)維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)起重要作用。目前,NF-κB活化的負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完善。我們發(fā)現(xiàn)IKIP(IKK-interactingprotein,IKIP)能夠通過與NEMO競爭性的結(jié)合IKKα/IKKβ抑制IκB激酶(IKB kinase,IKK)復(fù)合體的形成,從而阻礙IKKα/β的磷酸化進(jìn)程并負(fù)向調(diào)節(jié)下游NF-κB信號(hào)通路的活化。LPS、poly(I:C)、TNF-α和IL-1β等刺激劑激活信號(hào)通路時(shí),Ikip缺陷小鼠巨噬細(xì)胞中IKKα/β、IκB和p65的磷酸化更強(qiáng),TNF-α和IL-6的表達(dá)更多;脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的膿毒性休克模型和硫酸葡聚糖鈉(Dextran Sulfate Sodium,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中,Ikip缺陷小鼠更易感。綜上所述,本課題研究揭示了 IKIP在NF-κB信號(hào)中的負(fù)向調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制,豐富了 NF-κB的負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制,并為IKK的激活調(diào)控提供了新的分子機(jī)制,可能有助于炎癥性疾病新治療策略的發(fā)展。研究目的1.明確IKIP在NF-κB活化和炎癥反應(yīng)中的作用。2.探究IKIP在NF-κB信號(hào)通路中的作用機(jī)制。研究方法1.明確IKIP與IKK復(fù)合體的相互作用及其相互作用的結(jié)構(gòu)域。1.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確IKIP與IKK復(fù)合體的相互作用;將Myc標(biāo)簽的IKIP1和IKIP2表達(dá)質(zhì)粒分別與HA標(biāo)簽的IKK復(fù)合體表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,24小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白,使用Myc標(biāo)簽抗體做免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP),通過蛋白印跡(western blot,WB)檢測IKIP與IKK復(fù)合體之間的相互作用。1.2體外實(shí)驗(yàn)明確IKIP與IKK復(fù)合體的相互作用;將重組蛋白質(zhì)IKIP1和IKKβ在體外結(jié)合反應(yīng)體系中混合孵育,使用IKKβ抗體做Co-IP,通過WB檢測兩者結(jié)合情況。1.3免疫熒光實(shí)驗(yàn)明確IKIP在細(xì)胞內(nèi)的定位及其與IKKβ的共定位;將Flag標(biāo)簽的IKIP1表達(dá)質(zhì)粒和Myc標(biāo)簽的IKKβ表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞,24小時(shí)后多聚甲醛固定細(xì)胞,分別用一抗IKIP、IKKβ、DPI和熒光二抗抗體標(biāo)記IKIP、IKKβ、ER。共聚焦顯微鏡觀察IKIP在細(xì)胞內(nèi)的定位及其與IKKβ的共定位情況,IKIP(紅色)、IKKβ(綠色)、DPI(ER Marker,綠色)、DAPI(細(xì)胞核,藍(lán)色)。1.4尋找相互結(jié)合的作用區(qū)域;將Myc標(biāo)簽的IKIP1和IKIP2表達(dá)質(zhì)粒分別與Flag-IKKβ、Flag-IKKβ-KD、Flag-IKKβ-HLH、Flag-IKKβ-LZ 表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到 HEK293T 細(xì)胞,24 小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白,使用Myc標(biāo)簽抗體做Co-IP,通過WB檢測結(jié)合情況;將Flag-IKKβ 表達(dá)質(zhì)粒與 Myc-IKIP1、Myc-IKIP2、Myc-IKIP1(99-377)、Myc-IKIP2(99-350)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞,24小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白,使用Flag標(biāo)簽抗體做Co-IP,通過WB檢測結(jié)合情況。2.IKIP調(diào)節(jié)NF-κB活化和炎癥反應(yīng)。2.1 IKIP對(duì)體外炎癥反應(yīng)的影響;取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞LPS在在(200ng/ml)、PGN(50 mg/ml)、poly(I:C)(20mg/ml)刺激指定時(shí)間點(diǎn),收取細(xì)胞的上清,ELISA檢測細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6的分泌情況;提取細(xì)胞的mRNA,RT-PCR檢測Tnfα、Il-6、Cxcl1和Nfkbiz mRNA水平的表達(dá)情況。同時(shí),在THP1細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染IKIP siRNAs,48h后LPS(200ng/ml)刺激2h,提取細(xì)胞mRNA,通過RT-PCR檢測細(xì)胞中TNF-α,IL-6mRNA水平的表達(dá)況。2.2 IKIP對(duì)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響;取Ikipfl/fl小鼠Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠腹腔注射LPS(20mg/kg),4h后取血清和肺臟組織。ELISA檢測血清中TNF-α和IL-6的表達(dá)情況;HE染色檢測肺臟的組織病理損傷情況和炎性細(xì)胞浸潤情況。2.3 IKIP對(duì)NF-κB活化的影響將NF-κB報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒和不同濃度IKIP表達(dá)質(zhì)粒分別在HEK293T,HEK293-TLR4/TLR2 細(xì)胞系中共轉(zhuǎn)染,24h 后,分別用 TNF-α(20 ng/ml)、LPS或PGN刺激指定時(shí)間點(diǎn),通過報(bào)告基因檢測NF-κB的活化情況;HEK293T細(xì)胞系中NF-κB報(bào)告基因質(zhì)粒和信號(hào)通路接頭分子表達(dá)質(zhì)粒與不同濃度的IKIP表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,24h后報(bào)告基因檢測NF-κB的活化情況。2.4 IKIP對(duì)p65入核的影響取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞,LPS刺激刺激指定時(shí)間點(diǎn),分別提取細(xì)胞質(zhì)和核蛋白,通過WB分析p65和IRF3入核情況。2.5 IKIP對(duì)NF-κB信號(hào)通路中分子磷酸化的影響;取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞,分別用LPS、poly(I:C)、IL-1β(10ng/ml)和TNF-α刺激不同時(shí)間點(diǎn),提取細(xì)胞蛋白,通過WB檢測NF-κB信號(hào)通路中IKKα/β、p65、IκB的磷酸化,IFN-β信號(hào)通路TBK1,IRF3的磷酸化;MAPK信號(hào)通路中JUNK、ERK和p38的磷酸化。將IKKβ表達(dá)質(zhì)粒在HEK293T過表達(dá)誘導(dǎo)信號(hào)通路的活化,同時(shí)梯度轉(zhuǎn)染IKIP表達(dá)質(zhì)粒,提取細(xì)胞蛋白,通過WB測IKKα/β的磷酸化;HEK293-TLR2細(xì)胞系梯度轉(zhuǎn)染IKIP表達(dá)質(zhì)粒,24h后,PGN刺激2h,提取細(xì)胞蛋白,通過WB檢測IKKα/β的磷酸化。2.6IKIP的作用靶點(diǎn);HEK293T細(xì)胞中,NF-κB報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒與NF-κB信號(hào)通路中接頭分子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,報(bào)告基因檢測NF-κB啟動(dòng)子活性;HEK293T細(xì)胞中,TBK1和IKIP表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,24小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白,通過WB檢測TBK1的磷酸化;HEK293T細(xì)胞中,IRSE報(bào)告基因質(zhì)粒與TBKI表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,同時(shí)轉(zhuǎn)染IKIP表達(dá)質(zhì)�；蚩蛰d體質(zhì)粒,利用報(bào)告基因檢測IRSE啟動(dòng)子活性。2.7 IKIP調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的功能域。將IKIP1和IKIP2表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)應(yīng)的突變株表達(dá)質(zhì)粒在HEK293-TLR2細(xì)胞系中過表達(dá),24h后,PGN刺激2h,提取細(xì)胞蛋白,通過WB檢測IKKα/β的磷酸化;將NF-κB報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒和IKIP兩個(gè)剪接體表達(dá)質(zhì)粒及其突變株表達(dá)質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞系中共轉(zhuǎn)染,TNF-α刺激或轉(zhuǎn)染信號(hào)通路接頭分子誘導(dǎo)信號(hào)通路的活化,報(bào)告基因檢測NF-κB啟動(dòng)子活性。3.IKIP在NF-κB信號(hào)通路中的作用機(jī)制。3.1 IKIP對(duì)IKK同源或異源二聚體形成的影響;HEK293T細(xì)胞中,Flag標(biāo)簽的IKKβ、HA標(biāo)簽的IKKα/β表達(dá)質(zhì)粒與Myc標(biāo)簽的IKIP共轉(zhuǎn)染,24小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白,使用Flag標(biāo)簽抗體做Co-IP,通過WB檢測IKKβ同源或異源二聚體的形成。3.2 IKIP對(duì)NEMO泛素化的影響;取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞,LPS刺激不同時(shí)間點(diǎn),提取細(xì)胞蛋白,使用NEMO抗體做Co-IP,通過WB檢測NEMO的內(nèi)源泛素化。3.3 IKIP對(duì)IKK復(fù)合體形成的影響。HEK293T細(xì)胞中,Myc標(biāo)簽的IKKβ表達(dá)質(zhì)粒與HA標(biāo)簽的NEMO表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,同時(shí)轉(zhuǎn)染不同濃度IKIP表達(dá)質(zhì)粒,提取細(xì)胞蛋白,使用Myc標(biāo)簽抗體做Co-IP,通過WB檢測IKKβ與NEMO的結(jié)合情況;將體外重組蛋白質(zhì)IKKβ和NEMO在體外結(jié)合反應(yīng)體系中混合,同時(shí)加入不同濃度的重組蛋白質(zhì)IKIP1孵育,使用IKKβ抗體做Co-IP,通過WB檢測IKKβ與NEMO及IKIP的結(jié)合;取野生小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞,LPS刺激不同時(shí)間點(diǎn),提取細(xì)胞蛋白,用IKKβ抗體做Co-IP,通過WB檢測內(nèi)源IKKβ與NEMO或IKIP的結(jié)合;取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞,LPS刺激不同時(shí)間點(diǎn),提取細(xì)胞蛋白,使用IKKβ抗體做Co-IP,通過WB檢測IKKβ與NEMO結(jié)合。4.IKIP在LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克模型和DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的作用。取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠(雄鼠,8周齡,各10只),腹腔注射LPS(30mg/kg),觀察小鼠的存活情況;取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠(雌性,6周齡,各5只)喂養(yǎng)3%(wt/vol)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎,每天監(jiān)測小鼠體重、糞便濃度和潛血,5天后換清水繼續(xù)飼養(yǎng)2天后處死小鼠,取小鼠的血清和結(jié)腸。ELISA檢測血清中細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá);測量結(jié)腸的長度并取結(jié)腸組織作病理切片HE染色,統(tǒng)計(jì)結(jié)腸長度變化并觀察結(jié)腸組織的病理損傷情況和炎性細(xì)胞浸潤情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論1.IKIP 結(jié)合 IKKα/IKKβ。1.1 IKIP1和IKIP2都可以結(jié)合IKKα/IKKβ但不與NEMO結(jié)合;1.2 IKIP1與IKKβ可以在體外反應(yīng)體系中直接結(jié)合;1.3 IKIP大部分定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上且與IKKβ存在明顯的共定位;1.4 IKIP通過N端1-99位的99個(gè)氨基酸與IKKβ的LZ和HLH結(jié)合。綜上所述,IKIP可以直接結(jié)合IKK復(fù)合體的催化亞基IKKα/IKKβ,但是不與調(diào)節(jié)亞基NEMO結(jié)合,這種相互作用主要依靠IKIP的N端結(jié)構(gòu)域和IKKβ的LZ與HLH結(jié)構(gòu)域。2.IKIP負(fù)調(diào)NF-κB活化和炎癥反應(yīng)。2.1 LPS、PGN、poly(I:C)刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞,Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠巨噬細(xì)胞中Tnα、Il-6、Cxcl1和Nfkbiz mRNA的表達(dá)量及巨噬細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6分泌量明顯高于Ikipfl/fl小鼠;THP1細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾RNA敲低IKIP在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平,TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)升高;2.2腹腔注射LPS(20mg/kg),Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠血清中TNF-α和IL-6的表達(dá)量明顯高于Ikipfl/fl小鼠;Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠肺臟組織中的炎性細(xì)胞浸潤及組織損傷與Ikipfl/fl小鼠比較更加明顯;2.3 IKIP抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化并存在劑量依賴性;LPS或PGN誘導(dǎo)的NF-κB活化同樣被IKIP抑制;2.4 IKIP抑制LPS誘導(dǎo)的p65入核;而不影響LPS誘導(dǎo)的IRF3的入核;2.5 LPS、poly(I:C)、IL-1β 和 TNF-α 刺激原代腹腔巨噬細(xì)胞,Ikipfl/flLyz2-Cre 小鼠細(xì)胞的IKBα和p65的磷酸化水平比Ikipfl/fl小鼠高,而JNK、ERK、p38、IRF3和TBK1的磷酸化在不同小鼠間無明顯差異;IKIP可以抑制IKKβ的自磷酸和PGN誘導(dǎo)的IKKα/β磷酸化;2.6IKIP負(fù)調(diào)IKKα/β和上游接頭分子(TRIF、MyD88、TRAF6,、IKKα、IKKβ、p65)誘導(dǎo)的NF-κB活化不影響TBK1的功能。2.7 IKI1和IKIP2抑制PGN誘導(dǎo)的IKKα/β磷酸化而突變株不影響IKKα/β磷酸化;IKP1和IKIP2抑制NF-κB啟動(dòng)子活性而突變株不影響NF-κB啟動(dòng)子活性。綜上所述,IKIP通過N端1-99位的99個(gè)氨基酸結(jié)合IKKα/β抑制其磷酸化進(jìn)而并負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB活化和炎癥反應(yīng)。3.明確IKIP在NF-κB信號(hào)通路中的作用機(jī)制。3.1 IKIP不影響IKK同源或異源二聚體的形成;3.2 IKIP不影響NEMO的泛素化;3.3 IKIP抑制IKKβ與NEMO的結(jié)合;LPS刺激后,IKIP缺失促進(jìn)了 IKKβ與NEMO的結(jié)合。綜上所述,IKIP主要是通過與NEMO競爭結(jié)合IKKβ影響復(fù)合體的形成從而抑制NF-κB活化和炎癥反應(yīng)。4.明確IKIP在LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克模型和DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的作用。LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克模型中,與Ikipfl/fl小鼠相比npIipfl/flLyz2-Cre小鼠更易感,死亡率更高;DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中,與Ikipfl/fl小鼠相比,Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠體重降低更快;疾病患病更加嚴(yán)重;同時(shí)Ikipfl/flILyz2-Cre小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平更高;與Ikipfl/fl小鼠相比,Ikipfl/flILyz2-Cre小鼠的結(jié)腸更短且病理損傷更嚴(yán)重。綜上所述,敲除IKIP增加了小鼠在LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克模型和DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的易感性。創(chuàng)新性IKIP作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的分子,其功能的研究尚不完善,我們深入研究了 IKIP對(duì)NF-κB活化和炎癥反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控作用,同時(shí)解釋了 IKIP負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB活化和炎癥的機(jī)制,豐富了 NF-κB的負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制,并為IKK的激活調(diào)控提供了新的分子機(jī)制,可能有助于炎癥性疾病新治療策略的發(fā)展。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

?＋?＋?－?？??ＩＫＩＰ?ＤＰＩ?ＤＡＰ?丨?Ｍｅｒｇｅ?Ｈ＾ｉＫＫＰ?－?－?＋?＋?＋??■?Ｆｌａｇ－ＩＫＩＰ１?＋?＋?Ｆｌａｇ－ＩＫＩＰ１?－?＋?－?＋??？?＊＊?ＩＢ：Ｍｙｃ?—＊??｜?ｍｎａｇ?丨?＿?＿丨?ＩＢ，｜３ｇ?１?—??．ｉ?ＩＢ：ＨＡ?？？?＊＊＊?ＩＢ：Ｍｙｃ???＿?￣??＾＇＾１ＩＬ?ＪｎＩ?ＨＫｆｌＨ?Ｗ－?ｌｎｐｕｔ??１?ｉｎｐｕｔ?，???ＩＢ?Ｆｌａｇ?｜?一?－—?｜?舊：Ｆｌａｇ?｜?■一?｜??圖１?ＩＫＩＰ與ＩＫＫａ／ＩＫＫｐ相互作用??（Ａ－Ｂ）將Ｍｙｃ標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒ＩＫ丨ＰＩ和ＩＫＩＰ２分別與ＨＡ標(biāo)簽的ＩＫＫａ，ＩＫＫＰ，?ＮＥＭＯ表??達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到ＨＥＫ２９３Ｔ細(xì)胞中，２４小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白，使用Ｍｙｃ標(biāo)簽抗體Ｃｏ－ＩＰ，使??用標(biāo)簽抗體ＨＡ、Ｍｙｃ通過ＷＢ檢測結(jié)合情況。??（Ｃ）將體外重組蛋白質(zhì)ＩＫＩＰ１和ＩＫＫｐ在體外結(jié)合反應(yīng)體系中混合孵育，使用ＩＫＫＰ抗體??Ｃｏ－ＩＰ，使用內(nèi)源性ＩＫＩＰ、ＩＫＫｐ抗體通過ＷＢ檢測結(jié)合情況。??（Ｄ）將Ｆｌａｇ標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒丨ＫＩＰ１和Ｍｙｃ標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒ＩＫＫｐ共轉(zhuǎn)染到Ｈｅｌａ細(xì)胞，２４??小時(shí)后多聚甲醛固定細(xì)胞，分別用ＩＫＩＰ、ＩＫＫｐ、ＤＰｌ和對(duì)應(yīng)的熒光二抗抗體標(biāo)記ＩＫＩＰ、ＩＫＫｐ、??ＥＲ。共聚焦顯微鏡觀察ＩＫＩＰ在細(xì)胞內(nèi)的定位及其與ＩＫＫｐ的共定位情況ＩＫＩＰ?（紅色）、ＩＫＫｐ??（綠色）、ＤＰＩ?（ＥＲＭａｒｋｅｒ，綠色）、ＤＡＰＩ?（細(xì)胞核，藍(lán)色）（標(biāo)注，１０ｕｍ）。??（Ｅ）將用Ｈａｇ標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒ＩＫＩＰ〗和ＨＡ標(biāo)簽的ＴＢＫ１、ＩＫＫＰ或Ｍｙｃ標(biāo)簽的ＴＡＫ１、??

?—?＝３??Ｍｙｃ－ＩＫＩＰ２（９９－３５０）?－?－?－?－?？?ｍｍ??舊?％?￣?！?ＩＰ％?響?ＩＰ＿??ｉＳＦｌａｇ?舊．Ｆｌａｇ??ＩＰ?Ｍｙｃ?＾?＾??Ｂ．Ｍｙｃ?■?？一??ｍｍ??＝ｉｌ??????Ｂ?Ｍｙｃ?ＩＢ．Ｍｙｃ??ｉＢ?ＦＩａｇ?卜?＿?一一一｜?＾?￣??ｉｎｐｕｔ?？曹?｜?丨叩?ｕｔ?＾?—有??ＩＢ：Ｍｙｃ?ＩＢ?Ｆｌａｇ?舊．Ｆｌａｇ??ｍｍ????ｍｍ??圖２?ＩＫＩＰ通過Ｎ端１－９９位的９９個(gè)氨基酸與ＩＫＫ（ｉ的ＬＺ和ＨＬＨ結(jié)合??（Ａ）人源ＩＫＩＰ丨和ＩＫＩＰ２的蛋白質(zhì)序列比對(duì)。??（Ｂ）分別將Ｍｙｃ標(biāo)簽的ＩＫＩＰ１、ＩＫ１Ｐ２表達(dá)質(zhì)粒與Ｆｌａｇ標(biāo)簽的ＩＫＫｐ、ＫＤ、ＨＬＨ、ＬＺ表??達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到ＨＥＫ２９３Ｔ細(xì)胞，２４小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白，使用Ｍｙｃ標(biāo)簽抗體做Ｃｏ－ＩＰ．使??用標(biāo)簽抗體Ｈａｇ、Ｍｙｃ通過ＷＢ檢測結(jié)合情況。??（Ｃ）將?Ｆｌａｇ?標(biāo)簽的?ＩＫＫｐ?表達(dá)質(zhì)粒與?Ｍｙｃ?標(biāo)簽的?ＫＩＰ１，?ＩＫ１Ｐ２，丨ＫＩＰ１?（９９－３７７），?ＩＫＩＰ２??（９９－３５０）表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到ＨＥＫ２９３Ｔ細(xì)胞，２４小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白，使用Ｆｌａｇ標(biāo)簽抗體??做Ｃｏ－ＩＰ，使用標(biāo)簽抗體Ｆｌａｇ、Ｍｙｃ通過ＷＢ檢測結(jié)合情況。??Ｆｉｇｕｒｅ?２．?Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ?ｒｅｇｉｏｎ?ｏｆ?ＩＫＩＰ?ｉｎｔｅｒａｃｔｓ?ｗｉｔｈ?ｔｈｅ?ＬＺ?ａｎｄ?ＨＬＨ?ｄｏｍａｉｎｓ?ｏｆ?ＩＫＫｐ??（Ａ）?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ａｌｉｇｎｍｅｎｔ?ｏｆ?ｈｕｍａｎ?ＩＫＩＰ１?ａｎｄ?ＩＫＩＰ

?門■?畫??ＬＰＳ（ｈ°）?Ｚ?￣ＰＧＮ（ｈ）?〇?８?ｐｏ�。ǎ欤海�°）（ｈ）?６?￣￣Ｌ８＾??Ｃ?Ｄ??３０＿?Ｃｔｒｌ?ｓ丨ＲＮＡ?彳?５Ｑ?口?ＣＭ?ｓｉＲＮＡ?４〇〇，??ｔｍ?／Ｋ）Ｐ?ｓｉＲＮＡＩ?■／ＪＯＰｓｉＲＮＡ?＿??｜?麵?國?ＩＫｔＰ?ｓｉＲＮＡ２?５?＾?｜?３００?＼??�。海欤欤欤�?？：ＬＭ?ｌ：ｉｍ??Ｔ?＾?ＬＰＳ（ｈ）?０?１２?４?ＬＰＳ（ｈ）?０?１２?４??／?／?／?／??＆聲＃＃??圖４．?ＩＫＩＰ負(fù)向調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生??（Ａ）取及；／，小鼠和小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞，分別用ＬＰＳ、ＰＧＮ和ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）??刺激不同的時(shí)間點(diǎn)，提取細(xì)胞ｍＲＮＡ，通過ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測７＞７／－？、／／－６、Ｃｘｃ／／和ＴＶ秘／ｚｍＲＮＡ??表達(dá)情況。??（Ｂ）取小鼠和／ｈｊ＾ｉｙｚ＾－Ｏｅ小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞，分別用ＬＰＳ、ＰＧＮ和ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）??４８??
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3 付曉;李慕;文平;;不可分型流感嗜血桿菌經(jīng)NF-κB信號(hào)通路抑制組蛋白脫乙酰酶活性促進(jìn)支氣管上皮炎癥反應(yīng)[J];中國病理生理雜志;2020年03期

4 林培紅;;HSP70、NF-κB與子癇前期發(fā)病的關(guān)系[J];中國當(dāng)代醫(yī)藥;2015年31期

5 李敏;劉耕陶;;雙環(huán)醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)和NF-κB活化的抑制作用[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2006年12期

6 王伶,胡堅(jiān),劉東,蘇海;NF-κB在冠心病中的表現(xiàn)[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);2003年06期

7 薛曉彤;曹明芳;;NF-κB在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的研究進(jìn)展[J];中醫(yī)臨床研究;2020年07期

8 鄒顯巍;吳珊;;大鼠腦出血后腦肺組織NF-κB的表達(dá)及其在急性肺損傷中的作用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年19期

9 傅艷妮;胡楚文;劉玲;紀(jì)風(fēng)濤;;七氟醚對(duì)大鼠急性肺損傷NF-кB活性的影響及肺保護(hù)作用[J];北方藥學(xué);2016年04期

10 史曉靜;王高頻;陶貴周;;阿托伐他汀通過抑制NF-κB對(duì)抗大鼠缺血再灌注心肌炎癥反應(yīng)和凋亡的機(jī)制[J];臨床心血管病雜志;2015年07期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 吳海峰;IKIP在NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制[D];山東大學(xué);2020年

2 李婷;基于“下法”脅腹寧顆粒治療慢性非萎縮性胃炎模型大鼠NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的實(shí)驗(yàn)研究[D];長春中醫(yī)藥大學(xué);2019年

3 肖碧環(huán);芍藥苷對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)的人黑素細(xì)胞PIG3V活性、炎癥因子及趨化因子表達(dá)影響及NF-κB通路研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2019年

4 劉毅;Icariin通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路降低TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和自噬抑制[D];華中科技大學(xué);2019年

5 于莎莎;Klotho通過NF-κB p65通路調(diào)節(jié)BAG3表達(dá)對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的作用機(jī)制[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

6 高純;HSPA13調(diào)控TNFα誘導(dǎo)的NF-κB激活及程序性死亡響應(yīng)[D];浙江大學(xué);2018年

7 李君;咖啡因通過NF-κB下調(diào)NLRP3對(duì)BPD肺保護(hù)作用的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

8 崔雪蓮;SPOCK1通過NF-κB通路介導(dǎo)EMT促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究[D];延邊大學(xué);2018年

9 王海舟;草魚NF-κB信號(hào)通路激活及其調(diào)控的分子機(jī)制[D];南昌大學(xué);2017年

10 蔣琳;蛋白酶體抑制劑通過抑制NF-κB和MAPKs信號(hào)通路防治牙周病的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 梁曉;清熱活血組分對(duì)急性腦梗死火毒證NF-κB炎癥信號(hào)通路調(diào)控作用研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2014年

2 高智群;黃芩苷對(duì)高脂血癥及脂多糖誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2011年

3 王穎;硒及NF-κB與自身免疫性甲狀腺疾病的相關(guān)性研究[D];南昌大學(xué);2013年

4 唐昭山;NF-κB信號(hào)通路在血根堿抗炎中的作用研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

5 趙學(xué)英;IKIP通過靶向IKKβ負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[D];山東大學(xué);2013年

6 劉琨瑩;中國NF銀行W支行信貸業(yè)務(wù)管理研究[D];大連理工大學(xué);2019年

7 李一田;基于NF-κB信號(hào)通路研究枸杞多糖拮抗雷公藤多苷生殖損傷作用機(jī)制[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2020年

8 李暢;金銀花顆粒劑對(duì)調(diào)節(jié)兔耳痤瘡NF-κB信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)研究[D];錦州醫(yī)科大學(xué);2019年

9 陸瑩;研究舍曲林對(duì)抑郁模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α/NF-κB信號(hào)通路的影響[D];延邊大學(xué);2019年

10 王露;circ-sirt1抑制THP-1單核細(xì)胞NF-κB激活和炎癥應(yīng)答[D];河北醫(yī)科大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2883485