本文關鍵詞：Rab蛋白在天然免疫及腫瘤中的功能學研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細胞的生命活動得以實現(xiàn)依賴于生物膜體系,通過膜的動態(tài)變化從而調(diào)控能量轉(zhuǎn)換、信號識別以及物質(zhì)運輸?shù)然镜纳^程。目前研究表明:有多個蛋白家族參與細胞膜的動態(tài)調(diào)節(jié),包括:可溶性NSF粘附蛋白受體蛋白(SNARE)、衣殼蛋白(Coats)、銜接蛋白(Tethers)、動力蛋白(Motor)和Rab蛋白。其中Rab蛋白作為一個組織和維持細胞內(nèi)膜動態(tài)變化的核心成員,在細胞內(nèi)的囊泡形成及轉(zhuǎn)運等各個環(huán)節(jié)發(fā)揮了重要作用。目前已知的哺乳細胞內(nèi)有超過70個Rab蛋白。通過各自的特異性的GTPase結(jié)構域從而高度定位在專屬囊泡的膜表面,發(fā)揮囊泡轉(zhuǎn)運的時空調(diào)節(jié)。在鳥苷酸交換因子(GDP/GTP exchange factor,GEF)的作用下,GTP替代Rab蛋白結(jié)構域上的GDP,使得Rab蛋白被激活。激活的Rab蛋白可以插入到待轉(zhuǎn)運的細胞器的膜上,進一步募集下游的相互作用蛋白,開始發(fā)揮其調(diào)節(jié)囊泡運輸?shù)淖饔谩ｋS著研究的不斷深入,對Rab蛋白的認知也從單純的調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運擴展到了天然免疫的調(diào)節(jié),影響癌癥進程等諸多方面。作為一個調(diào)控免疫反應的中心指揮站,樹突狀細胞(dendritic cell,DC)通過精確調(diào)控復雜的膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)以對抗病原體和腫瘤的入侵。從外源性抗原的吞噬、降解到MHC的負載,幾乎所有的抗原呈遞過程都在內(nèi)吞相關的轉(zhuǎn)運囊泡中進行;與此同時,樹突狀細胞通過識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)或危險相關分子模式(danger-associated molecular pattern,DAMP),觸發(fā)了多種胞內(nèi)囊泡表面的炎癥信號分子,從而分泌細胞因子或化學因子完成免疫反應的初始化過程。毫無疑問,Rab蛋白在樹突狀細胞免疫調(diào)控的過程中發(fā)揮了重要的膜轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)作用。例如:Rab27a可以限制吞噬體的酸化并啟動交叉呈遞;傷寒沙門菌通過拮抗Rab9而抑制抗原遞呈。因此,描繪樹突狀細胞中Rab調(diào)控的轉(zhuǎn)運網(wǎng)絡及機制將極大促進對樹突狀細胞天然防御的認知。為了細致的描繪樹突狀細胞中Rab蛋白的轉(zhuǎn)運網(wǎng)絡,我們首先構建了51個穩(wěn)定表達e Xact-6His-Rab融合蛋白的DC2.4細胞系。通過發(fā)展了一個新的串聯(lián)親和純化(Tandem affinity purification,TAP)平臺,簡便高效的對每個Rab蛋白相互作用蛋白復合物進行純化。通過液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry,LC-ESI MS)檢測,最終得到1670個獨特的蛋白并和51個Rab蛋白構成8874組相互作用蛋白對。隨后通過一個基于無偏見的比較指標算法(CompPASS)給每一個相互作用蛋白賦予權重打分,最終我們獲得373個獨特的高可信蛋白(high-confidence interacting proteins,HCIPs)構成了649組相互作用蛋白對。隨后,通過全面的蛋白質(zhì)組學分析并輔助于影像學技術,我們提出了多個Rab-Rab之間的亞網(wǎng)絡功能假說。特別的是,通過研究單核增生李斯特菌(L.monocytogenes)感染前后Rab32相互作用網(wǎng)絡的動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)Rab32-Phb-Phb2蛋白復合物在細菌的胞內(nèi)增殖過程中早期吞噬體的形成和細菌逃逸后的再次捕獲過程中發(fā)揮重要作用。此外,這三種蛋白在吞噬體向溶酶體過渡的過程中也是必不可少的�？傊�,通過系統(tǒng)性研究Rab蛋白囊泡轉(zhuǎn)運組織結(jié)構,進而發(fā)現(xiàn)Rab32-Phb-Phb2抗微生物的重要性,為今后進一步研究Rab蛋白的功能提供一個組學基礎。除了在天然免疫中發(fā)揮重要作用外,Rab蛋白也被證明參與了多種腫瘤細胞的遷移、入侵、增殖、信號轉(zhuǎn)導以及藥物耐受。這種情況的發(fā)生由于Rab蛋白介導的囊泡轉(zhuǎn)運失衡所導致。為此,我們研究了胃癌組織中所有Rab的mRNA水平變化,發(fā)現(xiàn)高表達Rab40b和腫瘤入侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病理分期密切相關,而且導致病人生存時間縮短。因此,我們認為Rab40b是胃癌的一個重要預后指標和潛在的生物治療靶點。
【關鍵詞】：Rab蛋白 串聯(lián)親和純化 質(zhì)譜 相互作用組 Rab32 Rab38 Phb Phb2 單核細胞增生李斯特菌
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392.11
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表5-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-14
• 第二章 Rab蛋白家族相互作用蛋白組鑒定14-34
• 2.1 材料與方法15-26
• 2.2 實驗結(jié)果26-31
• 2.3 討論31-32
• 2.4 小結(jié)32-34
• 第三章 解析Rab蛋白參與樹突狀細胞囊泡轉(zhuǎn)運規(guī)律34-49
• 3.1 材料與方法34-40
• 3.2 實驗結(jié)果40-48
• 3.3 討論48
• 3.4 小結(jié)48-49
• 第四章 Rab32-Rab38抑制李斯特菌胞內(nèi)增殖的功能研究49-68
• 4.1 材料與方法49-61
• 4.2 實驗結(jié)果61-65
• 4.3 討論65-67
• 4.4 小結(jié)67-68
• 第五章 Rab32-Phb-Phb2調(diào)控吞噬囊泡酸化而抑制李斯特菌增殖68-83
• 5.1 材料與方法68-78
• 5.2 實驗結(jié)果78-80
• 5.3 討論80-82
• 5.4 小結(jié)82-83
• 第六章 Rab40b在胃癌中的功能學研究83-90
• 6.1 主要實驗材料83-86
• 6.2 實驗結(jié)果86-89
• 6.3 討論89
• 6.4 小結(jié)89-90
• 全文總結(jié)90-91
• 參考文獻91-94
• 文獻綜述 囊泡轉(zhuǎn)運Rab蛋白家族研究進展94-104
• 參考文獻101-104
• 博士期間發(fā)表的論文104-105
• 致謝105

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本文編號：288651