本文關(guān)鍵詞：阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1活化治療小鼠急性胃潰瘍的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景急性胃潰瘍通常發(fā)生于過(guò)量吸煙飲酒、大量服用非甾體抗炎藥物和嚴(yán)重應(yīng)激損傷,包括燒傷、休克、外科手術(shù)和膿毒癥等。急性胃潰瘍主要表現(xiàn)為胃粘膜淺表且廣泛的病變。胃潰瘍并發(fā)上消化道出血具有較高的發(fā)病率和死亡率。目前,人們對(duì)于急性胃潰瘍的發(fā)病機(jī)制研究仍然不清楚,在眾多胃潰瘍的誘發(fā)因素中,高炎癥狀態(tài)被認(rèn)為是引起急性胃潰瘍和調(diào)節(jié)其嚴(yán)重程度的重要因素之一。Rozza AL等認(rèn)為細(xì)胞因子TNF-a、IL-6和IL-10在急性胃潰瘍過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。炎癥小體(Inflammasome)是多種蛋白聚合形成的復(fù)合體。作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,炎癥小體對(duì)很多疾病的發(fā)生和發(fā)展起著重要的調(diào)節(jié)作用,其中包括痛風(fēng)、肺損傷、糖尿病和登革熱等疾病。NLRP3炎癥小體(NLRP3 inflammasome)是目前研究最廣泛深入的一種炎癥小體,其主要包含識(shí)別蛋白NLP、銜接蛋白ASC和效應(yīng)蛋白Caspase-1。NLRP3炎癥小體識(shí)別蛋白NLP接觸并識(shí)別某些危險(xiǎn)刺激后自身發(fā)生聚集活化和信號(hào)傳導(dǎo),進(jìn)而引起效應(yīng)蛋白Caspase-1活化,而后引起促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的成熟和釋放,Akosua等認(rèn)為對(duì)炎癥小體適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)可以有效調(diào)控促炎性細(xì)胞因子的釋放。本課題主要研究阻斷NLRP3炎癥小體活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。鑒于Caspase-1蛋白是NLRP3炎癥小體中最關(guān)鍵的蛋白之一,并且Caspase-1蛋白是一個(gè)關(guān)鍵的促炎性細(xì)胞因子成熟和釋放的調(diào)節(jié)因子,在機(jī)體受到各種應(yīng)激刺激后起到重要的調(diào)節(jié)作用。因此,我們利用Caspase-1特異性阻斷劑AC-YVAD-CMK來(lái)阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化,研究其對(duì)小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍和酒精灌胃誘導(dǎo)小鼠急性胃潰瘍的保護(hù)作用。本課題發(fā)現(xiàn)阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化能夠明顯減輕小鼠急性胃潰瘍損傷,該保護(hù)作用主要是通過(guò)減輕急性胃潰瘍?cè)缙诘难装Y反應(yīng)和抑制胃粘膜細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的,保護(hù)作用的機(jī)制與阻斷NF-κB和P38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。第一部分小鼠急性胃潰瘍模型的制作和驗(yàn)證研究目的:根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究目的,制作合適的小鼠急性胃潰瘍模型并驗(yàn)證制作模型是否成功,為后續(xù)研究阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍保護(hù)作用及機(jī)制的研究提供研究基礎(chǔ)。研究方法:①小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍模型的制作過(guò)程如下:實(shí)驗(yàn)前給小鼠禁食24小時(shí),實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將小鼠置于冷束縛裝置中,使水浸沒(méi)到小鼠劍突平面,水溫控制在20℃左右,8小時(shí)后小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍模型制作完成。②另外一種無(wú)水酒精灌胃誘發(fā)小鼠急性胃潰瘍模型制作如下:實(shí)驗(yàn)前將小鼠禁食24小時(shí),無(wú)水酒精通過(guò)灌胃的方法注入小鼠胃內(nèi),對(duì)照組小鼠給予同樣劑量的PBS水灌胃。灌胃4小時(shí)后,酒精灌胃誘發(fā)小鼠急性胃潰瘍模型制作完成。研究結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)室研制一種簡(jiǎn)易小鼠冷束縛應(yīng)激性潰瘍制作裝置,該裝置獲得中國(guó)實(shí)用新型專利(專利號(hào)201420111867X)。在小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍和酒精灌胃誘導(dǎo)小鼠急性胃潰瘍模型中,受傷小鼠粘膜均有散在的多發(fā)出血點(diǎn),HE染色結(jié)果顯示損傷組小鼠胃粘膜病理改變明顯,并且組內(nèi)未見(jiàn)明顯差別。研究結(jié)論:利用大體照片和HE染色方法評(píng)估小鼠胃粘膜的組織病理變化,認(rèn)為兩種小鼠急性胃潰瘍模型制作成功。第二部分阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍的保護(hù)作用的研究研究目的:研究阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍的保護(hù)作用。研究方法:按照第一部分中介紹的方法制作兩種小鼠急性胃潰瘍模型,在兩個(gè)模型實(shí)驗(yàn)中分別將24只小鼠隨機(jī)分到4個(gè)組內(nèi):①對(duì)照組,②損傷組,③損傷+奧美拉唑組,④損傷+AC-YVAD-CMK組。安慰劑、奧美拉唑或者AC-YVAD-CMK在小鼠傷前半小時(shí)給藥。模型制作完成后,為進(jìn)行相關(guān)的組織病理分析,我們采用大體拍照和HE染色,并檢測(cè)胃粘膜表面胃液PH值和胃潰瘍指數(shù)。同時(shí),我們還通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平,利用免疫組化方法檢測(cè)胃組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況,通過(guò)Western blot方法檢測(cè)胃組織中IL-18和IL-1β的蛋白表達(dá)情況。為進(jìn)一步了解阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對(duì)冷束縛誘導(dǎo)的小鼠急性胃潰瘍模型中細(xì)胞凋亡的影響,我們還檢測(cè)了凋亡相關(guān)指標(biāo),通過(guò)Western blot方法檢測(cè)cleaved-Caspase-3、Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)情況,利用TUNEL染色的方法檢測(cè)胃粘膜細(xì)胞凋亡情況。另外,為了進(jìn)一步確認(rèn)阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍的保護(hù)作用,我們又在酒精灌胃誘發(fā)小鼠急性胃潰瘍模型中進(jìn)行了大體解剖和HE染色的相關(guān)檢測(cè)。研究結(jié)果:在阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化治療小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍的實(shí)驗(yàn)中,大體照片和HE染色的結(jié)果顯示AC-YVAD-CMK預(yù)處理小鼠的胃潰瘍和胃粘膜出血程度明顯輕于損傷組小鼠。為了進(jìn)一步量化結(jié)果,本研究還對(duì)胃粘膜表面胃液PH值和胃潰瘍指數(shù)進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍損傷組小鼠的胃液PH值為3.33±0.82,奧美拉唑治療組小鼠胃液PH值為4.83±0.75,該組小鼠胃液PH值明顯高于損傷組小鼠水平(P0.05),AC-YVAD-CMK治療組小鼠胃液PH值為4.17±0.41,與損傷組小鼠相比沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍損傷組小鼠的胃潰瘍指數(shù)為18.83±2.32,AC-YVAD-CMK治療組小鼠胃潰瘍指數(shù)降低為8.67±1.21(P0.01),在AC-YVAD-CMK和噢美拉唑治療的小鼠組間胃潰瘍指數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。為研究阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化在小鼠急性胃潰瘍?cè)缙诘目寡鬃饔?本研究還發(fā)現(xiàn)冷束縛損傷后小鼠胃組織中促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的表達(dá)明顯升高,AC-YVAD-CMK治療后兩種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)明顯降低(P0.05),而奧美拉唑治療組小鼠的IL-1β和IL-18的表達(dá)與損傷組小鼠未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1活化對(duì)小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍的保護(hù)作用,本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法在胃組織中標(biāo)記F4/80陽(yáng)性細(xì)胞,觀察胃組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠冷束縛應(yīng)激性損傷后胃組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加,AC-YVAD-CMK治療組小鼠的胃組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于損傷組小鼠。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AC-YVAD-CMK治療組小鼠血清TNF-α和IL-6水平顯著低于損傷組小鼠(分別為P0.01和P0.05)。為了進(jìn)一步評(píng)估阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化對(duì)小鼠冷束縛應(yīng)激性胃組織細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,本研究Western blot方法發(fā)現(xiàn)AC-YVAD-CMK治療組小鼠cleaved-Caspase-3/Caspase-3水平明顯低于損傷組小鼠(P0.05)。而且,Bax蛋白在損傷組和奧美拉唑治療組小鼠胃組織中的表達(dá)均高于對(duì)照組小鼠水平,AC-YVAD-CMK治療組小鼠Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。TUNEL染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示損傷組小鼠的胃粘膜上皮可見(jiàn)明顯的凋亡細(xì)胞,而AC-YVAD-CMK治療組小鼠凋亡細(xì)胞明顯減少。另外在阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化治療酒精灌胃誘導(dǎo)小鼠急性胃潰瘍的實(shí)驗(yàn)中,大體照片和HE染色的結(jié)果顯示AC-YVAD-CMK預(yù)處理的小鼠的胃潰瘍和胃粘膜出血程度明顯輕于損傷組小鼠。研究結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)證明阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化對(duì)小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍和酒精灌胃誘發(fā)的小鼠急性胃潰瘍均具有明顯的保護(hù)作用,該保護(hù)作用與阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化早期的抗炎和抗凋亡作用密切相關(guān)。第三部分阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍保護(hù)作用的機(jī)制研究研究目的:探討阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。研究方法:考慮到MAPK/NF-κB信號(hào)通路活化在小鼠急性胃潰瘍發(fā)病早期起著重要作用,為研究阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot方法對(duì)冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍小鼠胃組織中P38、P-P38和P-IκB蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。研究結(jié)果:實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)損傷組小鼠和損傷+奧美拉唑治療組小鼠胃組織中P-P38/P38的水平明顯高于對(duì)照組小鼠水平,而AC-YVAD-CMK治療組P-P38/P38的水平明顯低于損傷組和損傷+奧美拉唑治療組(P0.05)。而且,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)損傷組和奧美拉唑組小鼠胃組織中P-IκB蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組小鼠水平,AC-YVAD-CMK治療組中P-IκB蛋白水平明顯低于損傷組和奧美拉唑治療組(P0.05)。研究結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)證明阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍有明顯的保護(hù)作用,其機(jī)制與降低MAPK/NF-κB信號(hào)通路活性有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：胃潰瘍 小鼠 炎癥小體 NLRP3炎癥小體 Caspase-1 細(xì)胞因子 炎癥 凋亡 NF-κB P38 MAPK
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R573.1
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 英文縮寫(xiě)表14-16
• 引言16-19
• 第一部分 小鼠急性胃潰瘍模型的制作和驗(yàn)證19-36
• 前言19-21
• 材料和方法21-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-32
• 討論32-35
• 結(jié)論35-36
• 第二部分 阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1 蛋白活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍保護(hù)作用的研究36-63
• 前言36-38
• 材料和方法38-49
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-59
• 討論59-62
• 結(jié)論62-63
• 第三部分 阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1 蛋白活化對(duì)小鼠急性胃潰瘍保護(hù)作用機(jī)制的研究63-78
• 前言63-66
• 材料 和方法66-70
• 實(shí)驗(yàn) 結(jié)果70-74
• 討論74-77
• 結(jié)論77-78
• 綜述一78-83
• 綜述二83-88
• 參考文獻(xiàn)88-107
• 在讀期間發(fā)表論文107-110
• 獲獎(jiǎng)情況110-111
• 致謝111-114

  本文關(guān)鍵詞：阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1活化治療小鼠急性胃潰瘍的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：287827