本文關(guān)鍵詞：阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1活化治療小鼠急性胃潰瘍的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景急性胃潰瘍通常發(fā)生于過量吸煙飲酒、大量服用非甾體抗炎藥物和嚴重應(yīng)激損傷,包括燒傷、休克、外科手術(shù)和膿毒癥等。急性胃潰瘍主要表現(xiàn)為胃粘膜淺表且廣泛的病變。胃潰瘍并發(fā)上消化道出血具有較高的發(fā)病率和死亡率。目前,人們對于急性胃潰瘍的發(fā)病機制研究仍然不清楚,在眾多胃潰瘍的誘發(fā)因素中,高炎癥狀態(tài)被認為是引起急性胃潰瘍和調(diào)節(jié)其嚴重程度的重要因素之一。Rozza AL等認為細胞因子TNF-a、IL-6和IL-10在急性胃潰瘍過程中起著重要的調(diào)控作用。炎癥小體(Inflammasome)是多種蛋白聚合形成的復(fù)合體。作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,炎癥小體對很多疾病的發(fā)生和發(fā)展起著重要的調(diào)節(jié)作用,其中包括痛風(fēng)、肺損傷、糖尿病和登革熱等疾病。NLRP3炎癥小體(NLRP3 inflammasome)是目前研究最廣泛深入的一種炎癥小體,其主要包含識別蛋白NLP、銜接蛋白ASC和效應(yīng)蛋白Caspase-1。NLRP3炎癥小體識別蛋白NLP接觸并識別某些危險刺激后自身發(fā)生聚集活化和信號傳導(dǎo),進而引起效應(yīng)蛋白Caspase-1活化,而后引起促炎性細胞因子IL-1β、IL-18的成熟和釋放,Akosua等認為對炎癥小體適當?shù)恼{(diào)節(jié)可以有效調(diào)控促炎性細胞因子的釋放。本課題主要研究阻斷NLRP3炎癥小體活化對小鼠急性胃潰瘍損傷的保護作用及機制。鑒于Caspase-1蛋白是NLRP3炎癥小體中最關(guān)鍵的蛋白之一,并且Caspase-1蛋白是一個關(guān)鍵的促炎性細胞因子成熟和釋放的調(diào)節(jié)因子,在機體受到各種應(yīng)激刺激后起到重要的調(diào)節(jié)作用。因此,我們利用Caspase-1特異性阻斷劑AC-YVAD-CMK來阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化,研究其對小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍和酒精灌胃誘導(dǎo)小鼠急性胃潰瘍的保護作用。本課題發(fā)現(xiàn)阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化能夠明顯減輕小鼠急性胃潰瘍損傷,該保護作用主要是通過減輕急性胃潰瘍早期的炎癥反應(yīng)和抑制胃粘膜細胞凋亡實現(xiàn)的,保護作用的機制與阻斷NF-κB和P38 MAPK信號通路有關(guān)。第一部分小鼠急性胃潰瘍模型的制作和驗證研究目的:根據(jù)本實驗研究目的,制作合適的小鼠急性胃潰瘍模型并驗證制作模型是否成功,為后續(xù)研究阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對小鼠急性胃潰瘍保護作用及機制的研究提供研究基礎(chǔ)。研究方法:①小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍模型的制作過程如下:實驗前給小鼠禁食24小時,實驗開始時將小鼠置于冷束縛裝置中,使水浸沒到小鼠劍突平面,水溫控制在20℃左右,8小時后小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍模型制作完成。②另外一種無水酒精灌胃誘發(fā)小鼠急性胃潰瘍模型制作如下:實驗前將小鼠禁食24小時,無水酒精通過灌胃的方法注入小鼠胃內(nèi),對照組小鼠給予同樣劑量的PBS水灌胃。灌胃4小時后,酒精灌胃誘發(fā)小鼠急性胃潰瘍模型制作完成。研究結(jié)果:本實驗室研制一種簡易小鼠冷束縛應(yīng)激性潰瘍制作裝置,該裝置獲得中國實用新型專利(專利號201420111867X)。在小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍和酒精灌胃誘導(dǎo)小鼠急性胃潰瘍模型中,受傷小鼠粘膜均有散在的多發(fā)出血點,HE染色結(jié)果顯示損傷組小鼠胃粘膜病理改變明顯,并且組內(nèi)未見明顯差別。研究結(jié)論:利用大體照片和HE染色方法評估小鼠胃粘膜的組織病理變化,認為兩種小鼠急性胃潰瘍模型制作成功。第二部分阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對小鼠急性胃潰瘍的保護作用的研究研究目的:研究阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對小鼠急性胃潰瘍的保護作用。研究方法:按照第一部分中介紹的方法制作兩種小鼠急性胃潰瘍模型,在兩個模型實驗中分別將24只小鼠隨機分到4個組內(nèi):①對照組,②損傷組,③損傷+奧美拉唑組,④損傷+AC-YVAD-CMK組。安慰劑、奧美拉唑或者AC-YVAD-CMK在小鼠傷前半小時給藥。模型制作完成后,為進行相關(guān)的組織病理分析,我們采用大體拍照和HE染色,并檢測胃粘膜表面胃液PH值和胃潰瘍指數(shù)。同時,我們還通過ELISA方法檢測血清中細胞因子TNF-α和IL-6水平,利用免疫組化方法檢測胃組織中巨噬細胞浸潤情況,通過Western blot方法檢測胃組織中IL-18和IL-1β的蛋白表達情況。為進一步了解阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對冷束縛誘導(dǎo)的小鼠急性胃潰瘍模型中細胞凋亡的影響,我們還檢測了凋亡相關(guān)指標,通過Western blot方法檢測cleaved-Caspase-3、Caspase-3和Bax蛋白表達情況,利用TUNEL染色的方法檢測胃粘膜細胞凋亡情況。另外,為了進一步確認阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對小鼠急性胃潰瘍的保護作用,我們又在酒精灌胃誘發(fā)小鼠急性胃潰瘍模型中進行了大體解剖和HE染色的相關(guān)檢測。研究結(jié)果:在阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化治療小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍的實驗中,大體照片和HE染色的結(jié)果顯示AC-YVAD-CMK預(yù)處理小鼠的胃潰瘍和胃粘膜出血程度明顯輕于損傷組小鼠。為了進一步量化結(jié)果,本研究還對胃粘膜表面胃液PH值和胃潰瘍指數(shù)進行了相關(guān)檢測,發(fā)現(xiàn)冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍損傷組小鼠的胃液PH值為3.33±0.82,奧美拉唑治療組小鼠胃液PH值為4.83±0.75,該組小鼠胃液PH值明顯高于損傷組小鼠水平(P0.05),AC-YVAD-CMK治療組小鼠胃液PH值為4.17±0.41,與損傷組小鼠相比沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。同時本實驗還發(fā)現(xiàn),冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍損傷組小鼠的胃潰瘍指數(shù)為18.83±2.32,AC-YVAD-CMK治療組小鼠胃潰瘍指數(shù)降低為8.67±1.21(P0.01),在AC-YVAD-CMK和噢美拉唑治療的小鼠組間胃潰瘍指數(shù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。為研究阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化在小鼠急性胃潰瘍早期的抗炎作用,本研究還發(fā)現(xiàn)冷束縛損傷后小鼠胃組織中促炎性細胞因子IL-1β和IL-18的表達明顯升高,AC-YVAD-CMK治療后兩種促炎性細胞因子的表達明顯降低(P0.05),而奧美拉唑治療組小鼠的IL-1β和IL-18的表達與損傷組小鼠未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。為了進一步驗證阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1活化對小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍的保護作用,本實驗采用免疫組化方法在胃組織中標記F4/80陽性細胞,觀察胃組織中巨噬細胞浸潤情況。實驗發(fā)現(xiàn)小鼠冷束縛應(yīng)激性損傷后胃組織中巨噬細胞浸潤增加,AC-YVAD-CMK治療組小鼠的胃組織中巨噬細胞浸潤明顯少于損傷組小鼠。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)AC-YVAD-CMK治療組小鼠血清TNF-α和IL-6水平顯著低于損傷組小鼠(分別為P0.01和P0.05)。為了進一步評估阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化對小鼠冷束縛應(yīng)激性胃組織細胞凋亡的保護作用,本研究Western blot方法發(fā)現(xiàn)AC-YVAD-CMK治療組小鼠cleaved-Caspase-3/Caspase-3水平明顯低于損傷組小鼠(P0.05)。而且,Bax蛋白在損傷組和奧美拉唑治療組小鼠胃組織中的表達均高于對照組小鼠水平,AC-YVAD-CMK治療組小鼠Bax蛋白表達水平明顯降低(P0.05)。TUNEL染色的實驗結(jié)果顯示損傷組小鼠的胃粘膜上皮可見明顯的凋亡細胞,而AC-YVAD-CMK治療組小鼠凋亡細胞明顯減少。另外在阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化治療酒精灌胃誘導(dǎo)小鼠急性胃潰瘍的實驗中,大體照片和HE染色的結(jié)果顯示AC-YVAD-CMK預(yù)處理的小鼠的胃潰瘍和胃粘膜出血程度明顯輕于損傷組小鼠。研究結(jié)論:本實驗證明阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化對小鼠冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍和酒精灌胃誘發(fā)的小鼠急性胃潰瘍均具有明顯的保護作用,該保護作用與阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化早期的抗炎和抗凋亡作用密切相關(guān)。第三部分阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化對小鼠急性胃潰瘍保護作用的機制研究研究目的:探討阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化對小鼠急性胃潰瘍保護作用的相關(guān)機制。研究方法:考慮到MAPK/NF-κB信號通路活化在小鼠急性胃潰瘍發(fā)病早期起著重要作用,為研究阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白活化對小鼠急性胃潰瘍保護作用的相關(guān)機制,本實驗通過Western blot方法對冷束縛應(yīng)激性胃潰瘍小鼠胃組織中P38、P-P38和P-IκB蛋白表達情況進行了檢測。研究結(jié)果:實驗發(fā)現(xiàn)損傷組小鼠和損傷+奧美拉唑治療組小鼠胃組織中P-P38/P38的水平明顯高于對照組小鼠水平,而AC-YVAD-CMK治療組P-P38/P38的水平明顯低于損傷組和損傷+奧美拉唑治療組(P0.05)。而且,實驗發(fā)現(xiàn)損傷組和奧美拉唑組小鼠胃組織中P-IκB蛋白的表達明顯高于對照組小鼠水平,AC-YVAD-CMK治療組中P-IκB蛋白水平明顯低于損傷組和奧美拉唑治療組(P0.05)。研究結(jié)論:本實驗證明阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1蛋白的活化對小鼠急性胃潰瘍有明顯的保護作用,其機制與降低MAPK/NF-κB信號通路活性有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：胃潰瘍 小鼠 炎癥小體 NLRP3炎癥小體 Caspase-1 細胞因子 炎癥 凋亡 NF-κB P38 MAPK
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R573.1
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 英文縮寫表14-16
• 引言16-19
• 第一部分 小鼠急性胃潰瘍模型的制作和驗證19-36
• 前言19-21
• 材料和方法21-29
• 實驗結(jié)果29-32
• 討論32-35
• 結(jié)論35-36
• 第二部分 阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1 蛋白活化對小鼠急性胃潰瘍保護作用的研究36-63
• 前言36-38
• 材料和方法38-49
• 實驗結(jié)果49-59
• 討論59-62
• 結(jié)論62-63
• 第三部分 阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1 蛋白活化對小鼠急性胃潰瘍保護作用機制的研究63-78
• 前言63-66
• 材料 和方法66-70
• 實驗 結(jié)果70-74
• 討論74-77
• 結(jié)論77-78
• 綜述一78-83
• 綜述二83-88
• 參考文獻88-107
• 在讀期間發(fā)表論文107-110
• 獲獎情況110-111
• 致謝111-114

  本文關(guān)鍵詞：阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1活化治療小鼠急性胃潰瘍的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：287827