背景整體觀是祖國醫(yī)學(xué)基本哲學(xué)觀,整體觀哲學(xué)強(qiáng)調(diào)人是有機(jī)的整體,機(jī)體整體與局部在生理與病理中都存在相互聯(lián)系及影響。近年來2型糖尿病與退行性腰椎管狹窄癥之間的關(guān)系研究成為了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的熱門領(lǐng)域。祖國醫(yī)學(xué)在早期亦介紹此全身影響性疾病消渴對局部腰痹病存在影響,并提示兩者的媒介因素可能是血瘀�，F(xiàn)代炎癥反應(yīng)概念是祖國醫(yī)學(xué)血瘀內(nèi)涵的重要部分之一,其也是結(jié)締組織纖維化的重要環(huán)節(jié)。本課題在中醫(yī)整體觀理論指導(dǎo)下,通過現(xiàn)代實驗技術(shù)探究全身性代謝性疾病2型糖尿病(屬于消渴范疇)對脊柱局部常見的退行性腰椎管狹窄(屬于腰痹病范疇)黃韌帶肥厚的具體作用機(jī)制及中藥在其防治方面的潛在價值研究。目的在中醫(yī)整體觀指導(dǎo)下,通過回顧性分析,探究全身性代謝性疾病2型糖尿病(屬于消渴范疇)對局部退行性腰椎管狹窄(屬于腰痹病范疇)患者中椎管內(nèi)黃韌帶等重要參數(shù)的影響;通過人體黃韌帶組織檢測及病理分析、體外實驗研究,探討巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)及其相關(guān)的促纖維化炎癥介質(zhì)在黃韌帶中含量、對應(yīng)黃韌帶病理學(xué)改變以及MIF對黃韌帶效應(yīng)細(xì)胞的促炎性機(jī)理,闡明血瘀理論概念下的炎癥反應(yīng)在兩者之間的關(guān)系;根據(jù)“從瘀而治”理論,探討活血化瘀中藥姜黃有效成分姜黃素對MIF作用于成纖維細(xì)胞的干預(yù)效應(yīng)。方法第一部分:在中醫(yī)整體觀指導(dǎo)下,回顧性分析中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院3年來(2016年1月1日-2019年1月1日)診斷為退變性腰椎管狹窄癥住院病人。在雙盲前提下測量并對比合并2型糖尿病(DM+)與非合并2型糖尿病(DM-)兩組人群之間在黃韌帶厚度、下關(guān)節(jié)突間距、椎管有效腔隙矢狀徑方面的情況,研究兩組人群之間是否存在差異性。第二部分:前瞻性設(shè)計:在2018年8月27日-2019年5月29日,結(jié)合診斷、納入、排除標(biāo)準(zhǔn),錄入湖北六七二中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院所有脊柱外科40例退行性腰椎管狹窄癥手術(shù)患者。根據(jù)合并2型糖尿病與否分為DM+組和DM-組。40例患者中合并2型糖尿病20例(DM+組),其中男性8例,女性12例,平均年齡61.55±2.41歲,BMI:25.62±0.785,該組黃韌帶來源L4/L5水平14例,L5/S1水平4例,L3/L4水平2例;非糖尿病患者20例(DM-組),其中男性11例,女性9例,平均年齡58.85±3.78歲,BMI:23.60±0.643,該組黃韌帶來源L4/L5水平15例,L5/S1水平3例,L3/L4水平2例。術(shù)前根據(jù)Jong-Beom Park黃韌帶測量方法在腰椎MRI水平面上測量手術(shù)節(jié)段黃韌帶厚度。術(shù)中40例黃韌帶樣本完整取出后按左右側(cè)分為a、b兩份(a份干冰盒收集后凍存、b份予以甲醛固定),a份采用ELISA技術(shù)檢測MIF及相關(guān)促纖維化炎癥介質(zhì)(TGF-β1、IL-1β、IL-6、TNF-αMMP-13)含量;b份采用Masson染色及IHC染色后Image-Pro Plus 6.0軟件對圖片進(jìn)行量化。運用影像、生化、統(tǒng)計方法來對比兩組樣本之間的差異。第三部分:采用NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)方法復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代(實驗用3-5代)進(jìn)行體外細(xì)胞實驗。1.正常(5mM葡萄糖)與高糖(25mM葡萄糖)濃度刺激NIH3T3細(xì)胞48小時,Western Blot檢測MIF的表達(dá)差異及鏡下觀察細(xì)胞增殖情況。2.引入外源性MIF(重組鼠巨噬細(xì)胞移動抑制因子,rmMIF),按濃度設(shè)置為N正常濃度對照組(2 ng/ml)、L低濃度組(4 ng/ml)、M中濃度組(10ng/ml)、H高濃度組(50 ng/ml)刺激NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行研究:(1)48h時間點光鏡下觀察比較不同濃度rmMIF對NIH3T3細(xì)胞增殖生長形態(tài)的影響;(2)分別在0、24、48、72h時間點予以CCK-8法檢測對比四組之間A450值(酶標(biāo)儀下450nm處的吸光度值);(3)48h流式細(xì)胞術(shù)檢測比較成纖維細(xì)胞增殖S期情況。3.設(shè)置正常濃度rmMIF(2ng/ml)、高rmMIF濃度(50ng/ml)、高rmMIF濃度+Rho激酶特異性抑制劑Y27632三組刺激NIH3T3細(xì)胞48 h后運用RT-PCR及Western Blot法檢測對比三組之間細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的m RNA與蛋白表達(dá)差異。第四部分:NIH3T3細(xì)胞體外實驗,分組設(shè)計:A組(無處理組)、B組(刺激組)加rm MIF(50ng/ml)、C組(抑制劑組)加rm MIF(50ng/ml)+ISO-1(20μM)、D組(姜黃素組)加rm MIF(50ng/ml)+姜黃素(20μM)與DMEM培養(yǎng)液一并置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h,分別采用:(1)CCK-8檢測法在48h對無處理組、刺激組、姜黃素組三組用酶標(biāo)儀測450 nm處的吸光度值(A450值);(2)運用RT-PCR及Western Blot方法檢測比較各組之間炎癥介質(zhì)(TGF-β1、MMP-13、IL-1β、IL-6、TNF-α)及膠原蛋白(COL-1、COL-3)的m RNA與蛋白表達(dá)差異。結(jié)果第一部分:通過測量與對比研究發(fā)現(xiàn),合并2型糖尿病組(DM+)與非合并2型糖尿病組(DM-)黃韌帶厚度為(5.23±0.71)mm vs(4.42±0.60)mm;下關(guān)節(jié)突間距為(11.32±1.23)mm vs(12.09±1.57)mm;椎管有效腔隙矢狀徑為(7.57±1.87)mm vs(8.24±1.74)mm;兩組在此三種參數(shù)中存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。第二部分:DM+組vs DM-組:黃韌帶厚度為(5.567±1.090)vs(4.828±0.552)mm;MIF含量為(312.105±80.820)vs(210.363±62.182)pg/mg protein;TGF-β1含量為(2728.121±890.373)vs(2170.131±689.459)pg/mg protein;MMP-13含量為(564.167±189.391)vs(379.841±101.363)pg/mg protein;IL-1β含量為(15.585±5.797)vs(10.785±2.787)pg/mg protein;IL 6含量為(17.238±4.449)vs(12.523±2.842)pg/mg protein;TNF-α含量為(13.947±4.688)vs(9.829±2.616)pg/mg protein;Masson染色后的膠原纖維膠原容積分?jǐn)?shù)為(50.354±9.762)vs(41.803±5.873);IHC中MIF陽性染色I(xiàn)OD為(2808.882±699.779)vs(1615.892±408.609)以上指標(biāo)在兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);IHC中MIF陽性染色棕色顆粒分布于黃韌帶成纖維細(xì)胞細(xì)胞核、胞質(zhì)內(nèi)以及基質(zhì)中,而且此病理現(xiàn)象在DM+組內(nèi)更加明顯。相關(guān)性分析顯示:黃韌帶內(nèi)的MIF濃度與厚度呈正相關(guān)(r=0.768,P=0.000)。第三部分:1.相比于正常糖濃度,體外高糖濃度下培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞對MIF蛋白的表達(dá)水平更高且48h時間點高糖濃度組NIH3T3細(xì)胞增殖明顯。2.(1)光鏡下可見同一時間點(48h)不同rm MIF濃度組間NIH3T3細(xì)胞生長呈現(xiàn)差異,rm MIF刺激濃度越高細(xì)胞密度越大;(2)CCK-8檢測顯示:正常、低、中、高rm MIF濃度組間A450值(48h)組間總體均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與正常濃度對照組相比,低、中、高rm MIF濃度組增殖活性高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示隨rm MIF濃度增加各組內(nèi)S期的細(xì)胞占比增多。3.rm MIF刺激NIH3T3細(xì)胞48 h后細(xì)胞Cyclin-D1的m RNA和蛋白表達(dá)增加,經(jīng)Rho途徑抑制劑阻滯后Cyclin-D1的m RNA和蛋白表達(dá)降低。第四部分:CCK-8檢測顯示:刺激組較無處理組A450值高(P0.05),姜黃素組較刺激組A450值降低(P0.05),姜黃素組與無處理組A450值無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);RT-PCR及Western Blot檢測顯示:B刺激組較A無處理組各因子膠原m RNA及蛋白表達(dá)更高(P0.05);D姜黃素組較B刺激組的表達(dá)降低(P0.05);D姜黃素組與C抑制劑組間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.合并2型糖尿病的腰椎管狹窄癥患者人群中,黃韌帶肥厚等3種參數(shù)退變程度明顯高于非糖尿病患者,證實了2型糖尿病是腰椎管狹窄,尤其是黃韌帶肥厚的易感因素。揭示全身代謝性因素可對腰椎局部產(chǎn)生影響,符合中醫(yī)整體觀理論;2.在2型糖尿病合并腰椎管狹窄患者的黃韌帶內(nèi)發(fā)現(xiàn)MIF及其相關(guān)的促纖維化炎癥介質(zhì)(TGF-β1、IL-1β、IL-6、TNF-αMMP-13)含量更高,其中MIF含量與黃韌帶厚度呈正相關(guān)。在合并2型糖尿病組內(nèi)黃韌帶樣本內(nèi)存在更明顯的彈力纖維降解及膠原纖維增生現(xiàn)象,而且該組人群MIF的含量高且在黃韌帶中的分布更加廣泛。3.高糖環(huán)境刺激成纖維細(xì)胞高表達(dá)的MIF可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及炎性介質(zhì)表達(dá),MIF參與的炎癥反應(yīng)可能在介導(dǎo)合并2型糖尿病的腰椎管狹窄黃韌帶肥厚病理過程中占主導(dǎo)地位,其中,MIF促進(jìn)的成纖維細(xì)胞增殖及膠原纖維增生可能是黃韌帶瘢痕修復(fù)致其肥厚的重要部分。炎癥反應(yīng)包括炎性損傷及修復(fù)兩重要部分,其是中醫(yī)血瘀理論的主要內(nèi)涵之一;4.活血化瘀中藥姜黃的有效成分姜黃素可有效地阻斷MIF對成纖維細(xì)胞的相關(guān)炎性及促增殖效應(yīng),這表明姜黃可能是防治2型糖尿病合并腰椎管狹窄黃韌帶肥厚的有效藥物之一,值得進(jìn)一步研究。以上研究進(jìn)一步說明了中醫(yī)整體觀在分析合并2型糖尿病的腰椎管狹窄黃韌帶肥厚機(jī)理中的重要指導(dǎo)作用,同時也有力地證明了血瘀是消渴影響腰痹病的重要媒介因素且活血化瘀藥遵循中醫(yī)“從瘀而治”理論可能是此類全身性慢性疾病并發(fā)腰椎黃韌帶肥厚尋找有效干預(yù)方法的重要指導(dǎo)依據(jù)之一。
【學(xué)位單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R274.9
【部分圖文】：

用邢文華與零剛新[13,14]描述的方法,兩側(cè)椎板交點c與椎體后緣中點d連線(椎管矢狀徑)上測量椎間盤后緣到兩側(cè)黃韌帶交點前緣的距離。1.2.4測量及統(tǒng)計學(xué)方法

371名腰椎狹窄癥患者中單節(jié)段狹窄144例,多節(jié)段狹窄227例,其中L1~S1每一節(jié)段狹窄具體分布如下:L1/L2 12例、L2/L3 70例、L3/L4193例、L4/L5 331例、L5/S1 88例(圖1-2),L4/L5為研究人群的腰椎狹窄癥發(fā)生率最高節(jié)段。在331例存在L4/L5水平狹窄的患者中合并2型糖尿病患者112例(DM+組)、非合并2型糖尿病患者219例(DM-組)。2.3 椎管內(nèi)各參數(shù)對比結(jié)果

首先對擬行手術(shù)治療的退行性腰椎管狹窄癥患者及家屬進(jìn)行常規(guī)術(shù)前談話,同時告知此次黃韌帶試驗內(nèi)容獲得知情同意并簽字�；颊呷砺樽砗笕「┡P位,腹部兩側(cè)軟枕懸空。術(shù)前透視定位并標(biāo)記手術(shù)節(jié)段后,進(jìn)行常規(guī)消毒鋪巾。后正中入路,切開皮膚、筋膜及深層肌肉韌帶,在保留棘上韌帶前提下,單極電刀棘突兩旁骨膜下剝離結(jié)合雙極電凝肌層止血,向下暴露椎板及椎板間隙,向外暴露至關(guān)節(jié)突外側(cè)。與以往雙側(cè)TLIF減壓的方式不同,為避免常規(guī)椎板咬骨鉗撕扯鉗咬影響黃韌帶纖維的結(jié)構(gòu),取黃韌帶標(biāo)本時上、外、下側(cè)止點盡量運用磨鉆打薄從開槽止點處骨質(zhì)后骨刀鑿除止點,內(nèi)側(cè)止點適當(dāng)牽開后用刀片沿棘突下由下向上切開取出。切除黃韌帶上、下、外側(cè)止點后以椎管穹隆為界將左右分兩側(cè)黃韌帶各自整塊取出,形態(tài)如蝴蝶翅膀(圖2-1)。手術(shù)中取出后馬上進(jìn)行初步洗凈、去除骨質(zhì)及背側(cè)附著軟組織。左側(cè)黃韌帶標(biāo)記為A(n)放入干冰盒內(nèi)轉(zhuǎn)入-80攝氏度保存,右側(cè)標(biāo)記為B(n)放入福爾馬林溶液中固定。2 方法
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本文編號：2882880