背景:侵襲性肺曲霉病是一種致死率較高的感染性疾病。急性白血病患者和造血干細(xì)胞移植曲霉菌感染患者的死亡率高達(dá)40%至50%。三唑類藥物是目前臨床上最主要的抗真菌藥物,而曲霉菌對三唑類藥物的耐藥率逐年增加,使得臨床上對曲霉菌感染的治療陷入困境。免疫調(diào)節(jié)聯(lián)合抗真菌治療被認(rèn)為是最有潛力的疾病改善措施,但目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的作用靶點(diǎn)。Toll樣受體7(TLR7)是一種位于細(xì)胞內(nèi)的高度保守的固有免疫病原模式識(shí)別受體。TLR7最初被認(rèn)為是識(shí)別病毒來源的單鏈RNA的受體。后有研究表明,除了病毒單鏈RNA外,TLR7還可以識(shí)別細(xì)菌釋放的核酸。而還有研究顯示,TLR7參與了白色念珠菌感染致病過程中免疫調(diào)節(jié);且有臨床研究表明,病人T淋巴細(xì)胞表面TLR7的表達(dá)水平與真菌感染呈負(fù)相關(guān)趨勢。近期有臨床研究報(bào)道TLR7的基因多態(tài)性與曲霉菌感染相關(guān),但TLR7是否參與宿主抗曲霉菌感染的免疫反應(yīng)過程尚未見報(bào)道。目的:本研究旨在明確TLR7在宿主抗曲霉菌感染免疫反應(yīng)中的作用,闡明其發(fā)揮作用的機(jī)制,為開發(fā)曲霉菌感染的免疫治療方法提供新思路。方法:選取實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)煙曲霉菌株AF293,經(jīng)支氣管給藥的方式建立侵襲性曲霉菌肺部感染模型,Q-PCR檢測TLR7在不同感染時(shí)間點(diǎn)小鼠標(biāo)本中的mRNA表達(dá)水平。建立免疫正常及免疫抑制兩種免疫狀態(tài)下野生(WT)和TLR7缺陷(TLR7~(-/-))小鼠曲霉菌感染模型,通過生存率實(shí)驗(yàn)、肺曲霉菌載量測定,明確TLR7在曲霉菌感染中作用;并通過外源性給予小鼠TLR7特異性激動(dòng)劑咪喹莫特(imiquimod,R837)處理,再次觀察小鼠生存率,驗(yàn)證TLR7在曲霉菌感染中的作用。通過肺組織病理切片HE染色、PAS染色以及檢測肺干濕比、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白水平,明確TLR7在曲霉菌感染后小鼠肺損傷中作用。采用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)分類計(jì)數(shù)WT和TLR7~(-/-)曲霉菌感染小鼠BALF中炎癥細(xì)胞,采用ELISA檢測肺部炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平,明確TLR7在曲霉菌感染中的免疫調(diào)控效應(yīng)。分離培養(yǎng)在天然免疫抗菌防御中發(fā)揮重要作用的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,在體外通過吞噬殺傷實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)TLR7對免疫細(xì)胞吞噬殺傷曲霉菌孢子功能的影響,明確TLR7在曲霉菌感染中發(fā)揮免疫調(diào)控作用的機(jī)制。通過巨噬細(xì)胞敲除實(shí)驗(yàn),明確巨噬細(xì)胞在曲霉菌感染宿主免疫防御中的作用。結(jié)果:1.TLR7在曲霉菌感染小鼠肺及脾組織中表達(dá)上調(diào)與對照組相比,在曲霉菌感染后12小時(shí)小鼠肺及脾組織中TLR7mRNA表達(dá)顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(肺p0.05,脾p0.01)。2.TLR7在侵襲性肺曲霉病中發(fā)揮有害作用1)生存率實(shí)驗(yàn)顯示,正常免疫狀態(tài)下,在高致死劑量的曲霉菌肺部感染模型中,WT小鼠全部死亡,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠生存率顯著提高(32%生存率,p0.001);在中等致死劑量的曲霉菌肺部感染模型中,WT小鼠全部死亡,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠生存率顯著提高(90%生存率,p0.001)。2)生存率實(shí)驗(yàn)顯示,正常免疫狀態(tài)下,在低致死劑量的曲霉菌感染W(wǎng)T小鼠中,與對照組相比,R837處理組小鼠全部死亡,生存率顯著降低(降低30%,p0.05);在相同感染劑量的TLR7~(-/-)小鼠中,R837處理組小鼠及對照組小鼠生存率均為90%,TLR7~(-/-)小鼠生存率顯著高于野生小鼠(p0.001),且當(dāng)TLR7缺陷時(shí),R837處理并未降低曲霉菌感染小鼠生存率(p0.05)。3)生存率實(shí)驗(yàn)顯示,免疫抑制時(shí),經(jīng)致死劑量的曲霉菌肺部感染后,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠生存率顯著提高(提高54%,p0.01),與正常免疫狀態(tài)的結(jié)果一致。3.TLR7缺陷使機(jī)體對曲霉菌的清除能力增強(qiáng)1)通過肺部病原載量分析,正常免疫狀態(tài)下,曲霉菌感染后第1天及第3天,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠肺組織中真菌載量顯著降低(p0.01),真菌清除能力增強(qiáng);肺組織切片標(biāo)本經(jīng)糖原染色后,可見TLR7~(-/-)小鼠曲霉菌孢子較WT小鼠少。2)通過肺部病原載量分析,免疫抑制時(shí),曲霉菌感染后第3天,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠肺組織中真菌載量顯著降低(p0.05),真菌清除能力增強(qiáng),與正常免疫狀態(tài)的結(jié)果一致。4.TLR7缺陷使曲霉菌感染小鼠肺損傷減輕1)肺組織病理學(xué)切片HE染色結(jié)果顯示,野生小鼠肺部出現(xiàn)嚴(yán)重壞死、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、上皮細(xì)胞脫落、出血和大量的炎癥細(xì)胞浸潤,TLR7~(-/-)小鼠病理損傷范圍小,損傷較野生小鼠減輕。2)肺干濕比及BALF總蛋白檢測結(jié)果顯示,在感染后第1天,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠肺濕重/干重比值顯著降低(p0.01),感染后第3天,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠BALF中總蛋白含量顯著降低(p0.05)。5.TLR7缺陷使曲霉菌感染小鼠肺部炎癥細(xì)胞募集減少1)通過牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)BALF中的WBC數(shù)目發(fā)現(xiàn),曲霉菌感染后3天,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)顯著減少(p0.05)。2)經(jīng)FCM對BALF中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),曲霉菌感染后3天,TLR7~(-/-)小鼠BALF中CD11b~+F4/80~+巨噬細(xì)胞比例增加(23%vs 14%),CD11b~+Ly6G~+中性粒細(xì)胞比例無顯著差異。與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠BALF中性細(xì)胞絕對值顯著降低(p0.05),而巨噬細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)無顯著差異。6.TLR7缺陷導(dǎo)致曲霉菌感染后炎癥細(xì)胞因子水平顯著降低而CCL2顯著增高通過ELISA檢測肺炎癥細(xì)胞因子和趨化因子水平發(fā)現(xiàn),與野生小鼠相比,在感染后1天,TLR7~(-/-)小鼠肺勻漿中,炎癥細(xì)胞因子IL-6(p0.01)及中性細(xì)胞趨化因子CXCL1(p0.05)水平顯著降低;在感染后3天,IL-17A水平顯著降低(p0.05),巨噬細(xì)胞趨化因子CCL2表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05)。而其他細(xì)胞因子(TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-27、IFN-a及IFN-γ)的水平無顯著差異。7.TLR7缺陷使巨噬細(xì)胞吞噬殺傷功能增強(qiáng)但不影響中性粒細(xì)胞吞噬殺傷功能體外分離培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,吞噬殺傷實(shí)驗(yàn)顯示,來自TLR7~(-/-)小鼠的原代巨噬細(xì)胞與來自WT小鼠原代巨噬細(xì)胞相比,吞噬、殺傷孢子功能顯著增強(qiáng)(p0.05),兩組小鼠原代中性粒細(xì)胞吞噬、殺傷孢子功能無顯著差異。8.巨噬細(xì)胞在曲霉菌感染宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用生存率結(jié)果表明,與對照組相比,巨噬細(xì)胞敲除后WT小鼠生存率顯著降低(降低約31%,p0.05)。結(jié)論:TLR7在侵襲性肺曲霉病動(dòng)物模型中表達(dá)顯著增高,并發(fā)揮了免疫損害作用。初步闡明了其作用機(jī)制,即TLR7通過抑制巨噬細(xì)胞的吞噬殺傷孢子功能,抑制機(jī)體清除曲霉菌孢子,進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),促進(jìn)炎癥細(xì)胞募集,促進(jìn)炎癥因子及趨化因子的分泌,加重肺損傷,引起曲霉菌感染小鼠死亡率增高,TLR7~(-/-)小鼠曲霉菌清除作用增強(qiáng),肺損傷減輕,生存率提高。這些結(jié)果提示,TLR7是一個(gè)良好的治療曲霉菌感染的免疫干預(yù)靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R519
【部分圖文】：

為探究TLR7是否可在曲霉菌感染中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,我們采用煙曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AF293,經(jīng)支氣管滴注的方式,建立了侵襲性肺煙曲霉菌感染模型。分別于感染的0 h、6 h、12 h、24 h、72 h,收集小鼠肺及脾組織,提取RNA,經(jīng)Q-PCR檢測TLR7的mRNA水平,結(jié)果顯示與PBS對照組相比,曲霉菌感染后6小時(shí)小鼠肺組織、脾組織中TLR7 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(圖1,肺p<0.05,脾p<0.001),提示TLR7可能在曲霉菌感染中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。3.2 TLR7在曲霉菌感染中發(fā)揮免疫損害作用

為探索TLR7在曲霉菌感染中的作用,我們采用高致死劑量(1.25×108CFU/只)和中等致死劑量(1.05×108CFU/只)的曲霉菌分別建立侵襲性肺曲霉菌感染模型,在不同程度致死劑量下,分別建立WT和TLR7-/-小鼠曲霉菌感染模型后,觀察小鼠14天生存率、小鼠狀態(tài)和體重變化。結(jié)果顯示:在高致死劑量的曲霉菌感染模型中,WT小鼠生存率為0%時(shí),TLR7-/-小鼠生存率為31.82%,與WT小鼠相比,TLR7-/-小鼠生存率顯著提高(p<0.001,圖2.1 A);在中等致死劑量的曲霉菌感染模型中,WT小鼠生存率為0%時(shí),TLR7-/-小鼠生存率為高達(dá)90%,與WT小鼠相比,TLR7-/-小鼠生存率顯著提高(p<0.001,圖2.1 B)。以上結(jié)果提示TLR7在曲霉菌性肺炎中發(fā)揮免疫損害作用。3.2.2 TLR7激動(dòng)劑處理曲霉菌感染小鼠生存率顯著降低

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TLR7在曲霉菌感染中的免疫損害作用,我們建立了低致死劑量(9.5×107CFU/只)曲霉菌感染模型,并采用TLR7激動(dòng)劑R837(imiquimod)分別處理曲霉菌感染W(wǎng)T和TLR7-/-小鼠,PBS處理組為對照組。如圖2.2所示,在曲霉菌感染的野生小鼠中,R837處理組小鼠生存率為0%,無內(nèi)毒素H2O對照組生存率為30%,與對照組相比,R837處理組小鼠生存率顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);在相同感染劑量的曲霉菌感染后的TLR7-/-小鼠中,R837處理組小鼠生存率為90%,無內(nèi)毒素H2O對照組生存率為90%,TLR7-/-小鼠生存率顯著高于野生小鼠(p<0.001),且當(dāng)TLR7缺陷后,R837處理并未降低曲霉菌感染小鼠生存率(p>0.05)。以上結(jié)果從正向驗(yàn)證了TLR7在曲霉菌性肺炎中發(fā)揮免疫損害作用。3.2.3 TLR7缺陷顯著提高免疫抑制狀態(tài)下曲霉菌感染小鼠生存率
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