研究背景:食管癌的發(fā)病具有明顯的地域差異,歐美等發(fā)達(dá)國家少見,東亞地區(qū)和非洲等地常見,我國是食管癌的高發(fā)地區(qū),病理類型以食管鱗癌為主。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,腫瘤的治療方式也出現(xiàn)了多元化,目前食管癌仍然以根治性手術(shù)、放射治療以及化學(xué)治療為主要治療手段,晚期病人可以考慮靶向以及免疫等新興治療方式。而放射治療在食管癌中的地位仍不可撼動,無論是對于術(shù)后患者還是不能手術(shù)的患者,放射治療均有著不可替代的作用。近年來,雖然食管癌的放射治療技術(shù)有了一定的進(jìn)步,但食管癌放療后局部復(fù)發(fā)及縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移仍是食管癌復(fù)發(fā)的常見復(fù)發(fā)模式,提示常規(guī)的放療劑量可能無法完全殺滅部分食管癌細(xì)胞。然而,心臟、肺、脊髓等重要器官的存在,限制了食管癌患者的放療劑量,且可能會引起放射性肺炎、放射性心包炎甚至放射性脊髓損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥。因此,增加食管癌的放療敏感性,可能會減少食管癌患者放療后的野內(nèi)復(fù)發(fā),減輕放射治療引起的并發(fā)癥,提高患者的生活質(zhì)量,并延長患者的總生存。紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞受體(erythropoietin-producing hepatocyte receptor,Eph)是酪氨酸激酶受體(Receptor Tyrosine Kinase,RTK)家族中最大的一個亞群,分為EphA和EphB兩類,Eph與其配體ephrin結(jié)合后可以介導(dǎo)雙向信號傳遞,調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、粘附和運(yùn)動等。EphA5是Eph家族的成員之一,以往關(guān)于EphA5基因的研究多集中在神經(jīng)系統(tǒng)方面,近來發(fā)現(xiàn)EphA5在腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控中也具有重要作用,并且還可能與藥物敏感性以及放療敏感性等相關(guān)。但是,EphA5在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)中的表達(dá)、作用以及與放療的關(guān)系尚不清楚。本課題,我們探討了 EphA5在食管鱗癌中的表達(dá)情況及其與放療敏感性的關(guān)系。研究目的:一 明確EphA5在食管鱗癌中的表達(dá)情況,分析EphA5的表達(dá)與食管鱗癌及其預(yù)后的關(guān)系。二 探討EphA5在食管鱗癌放射敏感性中的作用及其可能機(jī)制。研究方法:第一部分EphA5與食管鱗癌臨床病理參數(shù)及其預(yù)后的相關(guān)性分析1.病例收集:一收集2018年09月至2018年10月在江蘇省泰興市人民醫(yī)院接受手術(shù)的4例食管鱗癌患者的腫瘤組織及癌旁正常食管組織,獲取新鮮組織立即儲存至-80℃冰箱。二納入2015年01月日至2018年06月在江蘇省泰興市人民醫(yī)院接受根治性手術(shù)的食管鱗癌患者的石蠟包埋標(biāo)本共77例。收集病例資料包括:年齡、性別、組織學(xué)分級、T分期、N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、脈管和神經(jīng)侵犯情況、TNM分期等臨床特征。2.Western blot方法檢測EphA5在4例新鮮冰凍的食管鱗癌組織以及癌旁組織中的表達(dá)情況3.免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)檢測EphA5在77例食管鱗癌及20例相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況,并進(jìn)一步分析EphA5表達(dá)與患者性別、年齡、相關(guān)病理參數(shù)的關(guān)系。4.采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,分析EphA5表達(dá)與食管鱗癌患者的預(yù)后關(guān)系。第二部分EphA5影響X線照射后食管鱗癌細(xì)胞增殖、周期及侵襲的體外實(shí)驗1.RT-PCR、Western blot 檢測 EphA5 在食管鱗癌細(xì)胞株(KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYSE450、KYSE510)以及食管正常上皮細(xì)胞株(HEEC)中的表達(dá)情況。2.選擇EphA5高表達(dá)的KYSE150和KYSE450細(xì)胞株為研究對象,通過轉(zhuǎn)染siRNA(siRNA-1組,siRNA-2組)敲低EphA5的表達(dá)。分別采用RT-PCR、Western blot方法對2種食管鱗癌細(xì)胞株KYSE150,KYSE450對應(yīng)的siRNA-1組、siRNA-2組、NC組中EphA5 mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測,siRNA-1組的EphA5下調(diào)顯著,選擇siRNA-1組做后續(xù)試驗(后面si-EphA5組即轉(zhuǎn)染siRNA-1組),確定轉(zhuǎn)染后的食管鱗癌細(xì)胞中EphA5呈現(xiàn)低表達(dá)。3.KYSE150、KYSE450經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后,采用6MV X射線進(jìn)行單次照射,通過CCK8實(shí)驗、克隆形成實(shí)驗、劃痕實(shí)驗、Transwell侵襲實(shí)驗以及流式細(xì)胞術(shù),檢測6MVX射線單次照射后的食管鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲能力、凋亡以及周期的變化。第三部分EphA5影響食管鱗癌放射敏感性機(jī)制的初步探討1.通過轉(zhuǎn)染siRNA敲低食管癌細(xì)胞中EphA5的表達(dá),給予6MV X線單純照射,照射后不同時間段,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測p-ATM以及γH2AX的變化。2.轉(zhuǎn)染siRNA后的食管鱗癌細(xì)胞,照射后0h、0.5h、24h提取細(xì)胞蛋白,利用 Western blot 檢測相關(guān)蛋白的表達(dá),如 p-ATM、p53、p-p53(S15)、CHK2、p-CHK2、p21、cdc2、p-cdc2、cyclinB1 等的變化。研究結(jié)果:第一部分食管鱗癌組織中EphA5的表達(dá)較癌旁組織升高,且與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)1.Western blot結(jié)果提示食管鱗癌組織的EphA5表達(dá)均較癌旁組織高,兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.免疫組化檢測共納入77例食管鱗癌患者,中位年齡為65歲(范圍為43-80歲)。58例(75.32%)為男性,19例(24.68%)為女性;按組織學(xué)分級,高分化癌和中分化癌共64例(83.12%),低分化癌共13例(16.88%):根據(jù)腫瘤侵犯深度,T1、T2患者37例(48.05%),T3、T4患者40例(51.95%);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者37例(48.05%),淋巴結(jié)陰性患者40例(51.95%);脈管/神經(jīng)陽性者19例(24.68%),陰性者58例(75.32%);參照第8版AJCC TNM分期,所有患者中,Ⅰ期、Ⅱ期 31 例(40.26%),Ⅲ、ⅣA 期 46 例(59.74%)。3.與正常癌旁組織相比,免疫組化提示食管鱗癌組織中EphA5蛋白的表達(dá)升高,在食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá),且在不同食管鱗癌患者中的表達(dá)具有差異。EphA5在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織,77例食管癌患者中78%有EphA5表達(dá),而其中相應(yīng)的20例癌旁組織僅在基底細(xì)胞有少許表達(dá),分化好的鱗狀上皮不表達(dá),提示食管鱗癌組織和癌旁組織的EphA5表達(dá)有明顯差異。4.EphA5高表達(dá)者局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較常見,提示EphA5表達(dá)水平與食管鱗癌的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),而與患者年齡、性別、TNM分期、T分期、神經(jīng)侵犯、脈管癌栓以及腫瘤分化程度等無顯著相關(guān)性。5.EphA5低表達(dá)和高表達(dá)患者2年生存率為78.5%和64.3%,2年復(fù)發(fā)率(包括局部和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā))為37.5%和57.14%,但是兩組的2年生存率比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.16),而2年復(fù)發(fā)率顯示出統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。提示EphA5高表達(dá)患者預(yù)后欠佳。第二部分EphA5下調(diào)后食管鱗癌細(xì)胞的放射敏感性增加1.RT-PCR結(jié)果顯示,siRNA轉(zhuǎn)染KYSE150和KYSE450細(xì)胞后,與NC組相比,siRNA-1和siRNA-2組中EphA5的mRNA的表達(dá)均有下調(diào)。Western blot結(jié)果顯示,KYSE150和KYSE450細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-1和siRNA-2后,與NC組相比,EphA5蛋白條帶均減弱。而無論是基因還是蛋白水平,轉(zhuǎn)染siRNA-1的細(xì)胞均下調(diào)的更加明顯。因此,我們選擇了 siRNA-1序列(用si-EphA5表示)做后續(xù)的實(shí)驗。2.CCK8結(jié)果顯示,與NC組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染si-EphA5的KYSE150、KYSE450細(xì)胞的細(xì)胞生長活力48h內(nèi)變化不大,72h后生長活力稍有增加。但是經(jīng)6MVX線單純照射后,轉(zhuǎn)染si-EphA5的KYSE150,KYSE450細(xì)胞的細(xì)胞生長活力均被抑制,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.克隆形成實(shí)驗顯示,轉(zhuǎn)染si-EphA5的KYSE150,KYSE450細(xì)胞的克隆形成率均明顯低于NC組,不同劑量(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)的存活分?jǐn)?shù)(Surviving fraction,SF)均明顯低于NC組。KYSE150細(xì)胞EphA5低表達(dá)組的較NC組放射增敏比為1.56,KYSE450細(xì)胞EphA5低表達(dá)組的較NC組放射增敏比為1.21,表明EphA5下調(diào)后的食管鱗癌細(xì)胞具有較好的放射治療敏感性。4.下調(diào)EphA5表達(dá)后的食管鱗癌細(xì)胞,未經(jīng)6MVX線照射時,si-EphA5組和NC組的細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期均無明顯差異。經(jīng)6MV X線照射后,si-EphA5組和NC組的細(xì)胞凋亡率未見明顯差異,但是細(xì)胞周期差異明顯,照射24h后,與NC組相比,si-EphA5組細(xì)胞S期增多,G2期減少,而G1/S 比值下降,提示下調(diào)EphA5影響放療后細(xì)胞的周期可能與G1/S期檢查點(diǎn)不能有效激活有關(guān)。5.劃痕和侵襲實(shí)驗顯示,未經(jīng)6MV X線照射時,轉(zhuǎn)染si-EphA5后細(xì)胞的遷移及侵襲能力未被明顯抑制,但是經(jīng)6MVX線照射后,轉(zhuǎn)染si-EphA5后的食管癌KYSE150,KYSE450細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯受抑,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。第三部分EphA5調(diào)節(jié)食管鱗癌細(xì)胞的放射敏感性與ATM激活有關(guān)1.免疫熒光實(shí)驗顯示,給予6MVX線照射后0.5小時,NC組細(xì)胞出現(xiàn)大量的γH2AX焦點(diǎn),而si-EphA5組細(xì)胞的焦點(diǎn)卻比NC組少。同時我們也觀察到,NC組細(xì)胞在放療后8小時、24小時,γH2AX焦點(diǎn)均逐漸減少,提示NC組細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂得到了修復(fù)。但是,si-EphA5組細(xì)胞則表現(xiàn)出了更緩慢的DNA修復(fù)速率,在照射后8小時可見大量γH2AX焦點(diǎn)陽性細(xì)胞,24小時磷酸化γH2AX焦點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)仍較多。以上結(jié)果表明,下調(diào)EphA5不會導(dǎo)致照射后細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂增加,卻顯著的延緩了 DNA損傷修復(fù)的進(jìn)程。2.細(xì)胞周期結(jié)果顯示,下調(diào)EphA5可以導(dǎo)致放射治療后的食管癌細(xì)胞阻滯在S期,而G2期減少,G1/S比值下降,因此我們檢測了相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白。Westen blot結(jié)果顯示,與NC組相比,給予6MV X線照射后,下調(diào)EphA5后p53激活受抑,導(dǎo)致其下游分子p21表達(dá)減少;接受X線照射后0.5h,下調(diào)EphA5細(xì)胞的CHK2磷酸化水平較NC組細(xì)胞明顯減少,提示CHK2不能被有效激活。而與G2/M檢查點(diǎn)相關(guān)的cyclinB1、p-cdc2、cdc2在EphA5下調(diào)后變化不大。以上結(jié)果表明,下調(diào)EphA5抑制了 G1/S期檢查點(diǎn)的激活,導(dǎo)致的細(xì)胞周期的變化。3.DNA損傷引起ATM/ATR的激活,而ATM在DNA雙鏈斷裂中起主導(dǎo)作用。Westen blot和免疫熒光結(jié)果均顯示,給予6MV X線照射后,NC組的AMT在0.5h時明顯被激活,24h則p-AMT顯著下降;而下調(diào)EphA5后,AMT在0.5h時激活不明顯,較NC組減少,在24h仍有大量ATM處于激活狀態(tài),較NC組增多。上述結(jié)果表明,下調(diào)EphA5影響了 X線照射后食管鱗癌細(xì)胞的ATM激活狀態(tài)。結(jié)論:1.EphA5在食管鱗癌中相對高表達(dá),與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān),并且預(yù)示著較高的局部和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)率。2.下調(diào)EphA5可降低X線照射后食管鱗癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力,使得G1/S檢查點(diǎn)不能有效激活,細(xì)胞不能被有效的阻滯在G1期,更多的細(xì)胞進(jìn)入了 S期。3.下調(diào)EphA5影響了 X線照射后食管鱗癌細(xì)胞的ATM激活狀態(tài),使得DNA損傷不能有效的修復(fù),導(dǎo)致了食管鱗癌細(xì)胞的放射敏感性增加。4.EphA5有望成為食管鱗癌患者的預(yù)后以及放射敏感性的預(yù)測因子。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R735.1
【部分圖文】：

?山東大學(xué)博士學(xué)位論文???附圖表??％ｔ；ｋ－?：－??Ｂ?．?：??ｖ：／；??ｉｋｌｉｌｄｌｌｉｌ?麵：：ｌ：??．．？儀給■??圖１?ＥｐｈＡ５在食管鱗癌患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。??Ａ．?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測ＥｐｈＡ５在４例食管鱗癌患者腫瘤組織（Ｔｕｍｏｒ，?Ｔ）和癌??旁正常組織（Ｎｏｒｍａｌ，?Ｎ）的表達(dá)情況。Ｂ．?４例食管鱗癌患者癌組織及癌旁組織??ＥｐｈＡ５／Ｇａｐｄｈ值，癌組織和癌旁組織中ＥｐｈＡ５表達(dá)有差異，＂Ｐ＜０．０１。Ｃ．免疫組??化顯示食管鱗癌組織和癌旁組織中ＥｐｈＡ５的表達(dá)（２〇ｘ），細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)均??有表達(dá)。標(biāo)尺度，ｌ〇〇（ｉｒｎ。ａ癌旁組織；ｂＥｐｈＡ５陰性，ＳＩ分?jǐn)?shù)０；?ｃＥｐｈＡ５低表??達(dá)，０＜Ｓ丨分?jǐn)?shù)＜３；?ｄＥｐｈＡ５高表達(dá)，Ｓ丨分?jǐn)?shù)２３。??Ａ?Ｂ??＞?０．６－?１０．６－?１?，?￣＾???Ｓ??？?０．４－——ＥｐｈＡ５－ｌｏｗ?｜?０．４－?—?ＥｐｈＡ５－ｌｏｗ??Ｉ?〇?—?ＥｐｈＡ５－ｈｉｇｈ?Ｉ?ｎ〇?—?ＥｐｈＡ５－ｈｉｇｈ??Ｅ?０．２－?０．２－??３??Ｏ??０．０－?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?〇？〇?￣?ｉ?ｉ?ｉ?１＊１??０?５?１０?１５?２０?２５?０?５?１０?１５?２０?２５??ｔｉｍｅ（ｍｏｎｔｈｓ）?ｔｉｍｅ（ｍｏｎｔｈｓ）??圖２?７０例食管鱗癌患者ＥｐｈＡ５髙低表達(dá)的２年生存曲線圖和復(fù)發(fā)曲線圖。???Ａ．?ＥｐｈＡ５高表達(dá)患者的２年生存率低于低表達(dá)患者，但是無統(tǒng)計學(xué)差異，Ｐ＝０．ｌ６；??Ｂ．?ＥｐｈＡ５高表達(dá)患者的２年復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)患者，Ｐ＜０

??Ａ?Ｂ??＞?０．６－?１０．６－?１?，?￣＾???Ｓ??？?０．４－——ＥｐｈＡ５－ｌｏｗ?｜?０．４－?—?ＥｐｈＡ５－ｌｏｗ??Ｉ?〇?—?ＥｐｈＡ５－ｈｉｇｈ?Ｉ?ｎ〇?—?ＥｐｈＡ５－ｈｉｇｈ??Ｅ?０．２－?０．２－??３??Ｏ??０．０－?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?〇？〇?￣?ｉ?ｉ?ｉ?１＊１??０?５?１０?１５?２０?２５?０?５?１０?１５?２０?２５??ｔｉｍｅ（ｍｏｎｔｈｓ）?ｔｉｍｅ（ｍｏｎｔｈｓ）??圖２?７０例食管鱗癌患者ＥｐｈＡ５髙低表達(dá)的２年生存曲線圖和復(fù)發(fā)曲線圖。???Ａ．?ＥｐｈＡ５高表達(dá)患者的２年生存率低于低表達(dá)患者，但是無統(tǒng)計學(xué)差異，Ｐ＝０．ｌ６；??Ｂ．?ＥｐｈＡ５高表達(dá)患者的２年復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)患者，Ｐ＜０．０５。??２９??

?山東大學(xué)博士學(xué)位論文???Ａ????ＥｐｈＡ５丨一?一費(fèi)參麵一??Ｇａｐｄｈ?＾??，－翁??Ｂ??�。�?Ｊ?Ｉ?Ｉ??ｉＪｉｌｌ．Ｉｌｌ，８??圖１?ＥｐｈＡ５在不同食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況??Ａ．?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ方法檢測不同食管鱗癌細(xì)胞中ＥｐｈＡ５蛋白表達(dá)情；Ｂ．?ＲＴ－ＰＣＲ??檢測不同食管鱗癌細(xì)胞中ＥｐｈＡ５?ｍＲＮＡ表達(dá)。??４９??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2882279