椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneration,IVDD)是一種與年齡有關(guān)的退行性疾病。IVDD嚴(yán)重影響了患者的生活水平,增加了社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。椎間盤(pán)主要是由髓核(nucleus pulposus,NP)、纖維環(huán)(annulus fibrosus,AF)和軟骨終板(Cartilage endplate,CEP)三部分組成。椎間盤(pán)退變(IVDD)與髓核細(xì)胞的衰老密切相關(guān),隨著NP細(xì)胞衰老程度的增加,細(xì)胞中受損線粒體的積累增多,同時(shí)NP細(xì)胞數(shù)量減少,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)合成能力下降,炎癥因子分泌增多,最終導(dǎo)致細(xì)胞變性以及死亡。血紅素加氧酶(Heme Oxygenase,HO)-1是血紅素降解的限速酶,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗衰老的作用,在許多疾病中已被證實(shí)具有保護(hù)或延緩疾病進(jìn)展的作用。我們之前的研究已經(jīng)證實(shí)HO-1可以抑制椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的凋亡。然而,HO-1在NP細(xì)胞衰老和自噬中的作用尚不清楚。因此本課題擬從HO-1和細(xì)胞衰老表型在人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中的表達(dá);HO-1通過(guò)促進(jìn)線粒體途徑的自噬抑制髓核細(xì)胞的衰老;HO-1誘導(dǎo)的自噬抑制髓核細(xì)胞的退變這三個(gè)方面分別進(jìn)行闡述。第一部分:HO-1和細(xì)胞衰老表型在人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中的表達(dá)目的:探討在人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中HO-1與細(xì)胞衰老之間的相互作用關(guān)系。方法:獲取來(lái)自于正常和退變的人椎間盤(pán)髓核組織,進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)和免疫組化觀察H0-1和細(xì)胞衰老表型的表達(dá)情況。體外培養(yǎng)退變的人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞,取髓核細(xì)胞的P1,P3,P6代進(jìn)行實(shí)驗(yàn),采用細(xì)胞免疫熒光和western blot檢測(cè)各代髓核細(xì)胞HO-1和細(xì)胞衰老蛋白p16及p21的表達(dá)情況。采用SA-β-gal染色檢測(cè)髓核細(xì)胞衰老的情況。結(jié)果:人椎間盤(pán)髓核組織免疫組化顯示,與正常組相比,退變組HO-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,而退變組p21、p16陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多于正常組(P0.05)。人髓核組織western blot結(jié)果顯示,退變組HO-1表達(dá)降低,p16、p21表達(dá)升高(P0.05)。髓核細(xì)胞的免疫熒光和western blot實(shí)驗(yàn)表明隨著髓核細(xì)胞連續(xù)傳代,HO-1的表達(dá)水平降低,但是SA-β-gal染色水平和p16和p21表達(dá)水平卻明顯增加(P0.05)。結(jié)論:隨著椎間盤(pán)的退變,髓核細(xì)胞衰老增加,而HO-1的表達(dá)卻降低。第二部分:HO-1通過(guò)促進(jìn)線粒體途徑的自噬抑制髓核細(xì)胞的衰老目的:探討HO-1在髓核細(xì)胞衰老過(guò)程中的相關(guān)作用及其具體分子機(jī)制作用研究。方法:采用慢病毒過(guò)表達(dá)HO-1轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞,采用流式細(xì)胞周期檢測(cè)、SA-β-gal染色和western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組髓核細(xì)胞衰老的表達(dá)情況。采用透射電鏡、GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染和Mito-Tracker共轉(zhuǎn)染和western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)髓核細(xì)胞自噬的水平。采用JC-1染色、細(xì)胞內(nèi)ROS染色和透射電鏡檢測(cè)髓核細(xì)胞線粒體功能情況。結(jié)果:在通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的過(guò)表達(dá)HO-1的髓核細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HO-1的髓核細(xì)胞周期G1期細(xì)胞比例明顯較低(P0.05),同時(shí)SA-β-gal染色表達(dá)水平和衰老相關(guān)蛋白p16和p21表達(dá)都明顯降低(P0.05)。髓核細(xì)胞線粒體功能相關(guān)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HO-1的髓核細(xì)胞相比對(duì)照組線粒體膜電位明顯上升,且細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的含量明顯下降。在電鏡觀察顯示相比對(duì)照組,過(guò)表達(dá)HO-1的髓核細(xì)胞較少出現(xiàn)腫脹、嵴缺失的線粒體。以上提示HO-1能夠保護(hù)衰老髓核細(xì)胞線粒體的功能損傷。為進(jìn)一步研究結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)HO-1能夠明顯促進(jìn)髓核細(xì)胞的線粒體自噬,顯著提高了LC3-II蛋白表達(dá),而降低了P62表達(dá),且促進(jìn)Parkin蛋白主要從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體。GFP-LC3和Mito-Tracker共轉(zhuǎn)染激光共聚焦結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),過(guò)表達(dá)HO-1慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)數(shù)顯著增多,且促進(jìn)GFP-LC3和Mito-Tracker的共定位區(qū)域增加。電鏡結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)HO-1的髓核細(xì)胞中具有典型的雙膜自噬體,且自噬體中出現(xiàn)碎片化的線粒體的結(jié)構(gòu)。因此,這些結(jié)果提示HO-1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了髓核細(xì)胞的線粒體自噬。為進(jìn)一步了解自噬在HO-1對(duì)髓核細(xì)胞衰老的作用,采用自噬抑制劑3-MA處理髓核細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)3-MA處理后,髓核細(xì)胞的衰老蛋白p16、p21和p53的蛋白水平以及SA-β-gal染色表達(dá)水平明顯增加,且細(xì)胞的線粒體膜電位明顯下降。結(jié)論:HO-1抑制髓核細(xì)胞的衰老,可能是通過(guò)促進(jìn)線粒體途徑的自噬。第三部分:HO-1誘導(dǎo)的自噬抑制椎間盤(pán)的退變目的:進(jìn)一步探討HO-1誘導(dǎo)的自噬對(duì)椎間盤(pán)退變的影響方法:將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組,LV-NC組,LV-HO-1組和LV-HO-1+3-MA組。采用細(xì)胞免疫熒光,western blot和PCR檢測(cè)髓核細(xì)胞外基質(zhì)II型膠原(COL2)和聚蛋白多糖(AGG),同時(shí)檢測(cè)關(guān)鍵ECM代謝酶MMP-3和MMP-13表達(dá).最后采用直接椎間盤(pán)穿刺注射的方式將LV-HO-1注入兔IDD動(dòng)物模型體內(nèi),探討其對(duì)延緩椎間盤(pán)退變的實(shí)際療效。結(jié)果:髓核細(xì)胞被轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)HO-1慢病毒后,細(xì)胞免疫熒光,western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)提示II型膠原(COL2)和聚蛋白多糖(AGG)的表達(dá)水平明顯增加,而MMP-3和MMP-13表達(dá)明顯下降。而給予自噬抑制劑3-MA處理后,髓核細(xì)胞II型膠原(COL2)和聚蛋白多糖(AGG)的表達(dá)水平明顯降低,而MMP-3和MMP-13表達(dá)明顯增加。提示HO-1誘導(dǎo)自噬在椎間盤(pán)退變中起保護(hù)作用。最后兔椎間盤(pán)退變模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,HO-1能夠促進(jìn)髓核細(xì)胞的自噬水平,同時(shí)緩解椎間盤(pán)的衰老,從而抑制椎間盤(pán)的退變。結(jié)論:HO-1誘導(dǎo)的自噬抑制髓核細(xì)胞的退變
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類(lèi)】：R681.5
【部分圖文】：

5.附圖自噬是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中特有的,具有高度保守性的一種溶酶體依賴性降解代謝途徑,其主要的生理功能是參與受損的或者變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器清除,可以循環(huán)再利用細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì),并且在調(diào)控細(xì)胞衰老的各種生理病理過(guò)程中也發(fā)揮重要的作用,且在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及自我穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[1-6]。自噬的過(guò)程主要可以分為4個(gè)階段:(1)隔離膜的產(chǎn)生;(2)自噬泡的延伸與自噬體的形成;(3)自噬溶酶體的形成;(4)自噬溶酶體的降解。然后根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物進(jìn)入溶酶體的方式不同,將自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。我們通常所說(shuō)的自噬即為巨自噬,而巨自噬根據(jù)其降解對(duì)象的選擇性,又可將其分為非選擇性自噬(即一般自噬)和選擇性自噬。其中選擇性自噬主要包括CVT途徑、過(guò)氧化物酶體自噬和線粒體自噬等。線粒體自噬是一種選擇性自噬,能夠清除受損的線粒體,具有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要作用。目前許多的研究報(bào)道線粒體功能障礙被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的主要因素之一[7,8]。因此我們猜測(cè)線粒體自噬可能參與到髓核細(xì)胞的衰老的過(guò)程中,并且具體機(jī)制還不是非常清楚。

HO-1在衰老的髓核細(xì)胞中表達(dá)下降

HO-1過(guò)表達(dá)降低了人NP細(xì)胞的復(fù)制衰老
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