椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IVDD)是一種與年齡有關的退行性疾病。IVDD嚴重影響了患者的生活水平,增加了社會的經(jīng)濟負擔。椎間盤主要是由髓核(nucleus pulposus,NP)、纖維環(huán)(annulus fibrosus,AF)和軟骨終板(Cartilage endplate,CEP)三部分組成。椎間盤退變(IVDD)與髓核細胞的衰老密切相關,隨著NP細胞衰老程度的增加,細胞中受損線粒體的積累增多,同時NP細胞數(shù)量減少,導致細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)合成能力下降,炎癥因子分泌增多,最終導致細胞變性以及死亡。血紅素加氧酶(Heme Oxygenase,HO)-1是血紅素降解的限速酶,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗衰老的作用,在許多疾病中已被證實具有保護或延緩疾病進展的作用。我們之前的研究已經(jīng)證實HO-1可以抑制椎間盤髓核細胞的凋亡。然而,HO-1在NP細胞衰老和自噬中的作用尚不清楚。因此本課題擬從HO-1和細胞衰老表型在人椎間盤髓核細胞中的表達;HO-1通過促進線粒體途徑的自噬抑制髓核細胞的衰老;HO-1誘導的自噬抑制髓核細胞的退變這三個方面分別進行闡述。第一部分:HO-1和細胞衰老表型在人椎間盤髓核細胞中的表達目的:探討在人椎間盤髓核細胞中HO-1與細胞衰老之間的相互作用關系。方法:獲取來自于正常和退變的人椎間盤髓核組織,進行western blot實驗和免疫組化觀察H0-1和細胞衰老表型的表達情況。體外培養(yǎng)退變的人椎間盤髓核細胞,取髓核細胞的P1,P3,P6代進行實驗,采用細胞免疫熒光和western blot檢測各代髓核細胞HO-1和細胞衰老蛋白p16及p21的表達情況。采用SA-β-gal染色檢測髓核細胞衰老的情況。結果:人椎間盤髓核組織免疫組化顯示,與正常組相比,退變組HO-1陽性細胞數(shù)量明顯減少,而退變組p21、p16陽性細胞數(shù)量明顯多于正常組(P0.05)。人髓核組織western blot結果顯示,退變組HO-1表達降低,p16、p21表達升高(P0.05)。髓核細胞的免疫熒光和western blot實驗表明隨著髓核細胞連續(xù)傳代,HO-1的表達水平降低,但是SA-β-gal染色水平和p16和p21表達水平卻明顯增加(P0.05)。結論:隨著椎間盤的退變,髓核細胞衰老增加,而HO-1的表達卻降低。第二部分:HO-1通過促進線粒體途徑的自噬抑制髓核細胞的衰老目的:探討HO-1在髓核細胞衰老過程中的相關作用及其具體分子機制作用研究。方法:采用慢病毒過表達HO-1轉染髓核細胞,采用流式細胞周期檢測、SA-β-gal染色和western blot實驗檢測不同處理組髓核細胞衰老的表達情況。采用透射電鏡、GFP-LC3腺病毒轉染和Mito-Tracker共轉染和western blot實驗檢測髓核細胞自噬的水平。采用JC-1染色、細胞內(nèi)ROS染色和透射電鏡檢測髓核細胞線粒體功能情況。結果:在通過慢病毒轉染的過表達HO-1的髓核細胞中,實驗檢測發(fā)現(xiàn)過表達HO-1的髓核細胞周期G1期細胞比例明顯較低(P0.05),同時SA-β-gal染色表達水平和衰老相關蛋白p16和p21表達都明顯降低(P0.05)。髓核細胞線粒體功能相關檢測發(fā)現(xiàn)過表達HO-1的髓核細胞相比對照組線粒體膜電位明顯上升,且細胞內(nèi)活性氧ROS的含量明顯下降。在電鏡觀察顯示相比對照組,過表達HO-1的髓核細胞較少出現(xiàn)腫脹、嵴缺失的線粒體。以上提示HO-1能夠保護衰老髓核細胞線粒體的功能損傷。為進一步研究結果顯示過表達HO-1能夠明顯促進髓核細胞的線粒體自噬,顯著提高了LC3-II蛋白表達,而降低了P62表達,且促進Parkin蛋白主要從細胞質(zhì)轉運到線粒體。GFP-LC3和Mito-Tracker共轉染激光共聚焦結果進一步證實,過表達HO-1慢病毒轉染后細胞內(nèi)綠色熒光斑點數(shù)顯著增多,且促進GFP-LC3和Mito-Tracker的共定位區(qū)域增加。電鏡結果顯示過表達HO-1的髓核細胞中具有典型的雙膜自噬體,且自噬體中出現(xiàn)碎片化的線粒體的結構。因此,這些結果提示HO-1過表達促進了髓核細胞的線粒體自噬。為進一步了解自噬在HO-1對髓核細胞衰老的作用,采用自噬抑制劑3-MA處理髓核細胞,發(fā)現(xiàn)3-MA處理后,髓核細胞的衰老蛋白p16、p21和p53的蛋白水平以及SA-β-gal染色表達水平明顯增加,且細胞的線粒體膜電位明顯下降。結論:HO-1抑制髓核細胞的衰老,可能是通過促進線粒體途徑的自噬。第三部分:HO-1誘導的自噬抑制椎間盤的退變目的:進一步探討HO-1誘導的自噬對椎間盤退變的影響方法:將實驗分為對照組,LV-NC組,LV-HO-1組和LV-HO-1+3-MA組。采用細胞免疫熒光,western blot和PCR檢測髓核細胞外基質(zhì)II型膠原(COL2)和聚蛋白多糖(AGG),同時檢測關鍵ECM代謝酶MMP-3和MMP-13表達.最后采用直接椎間盤穿刺注射的方式將LV-HO-1注入兔IDD動物模型體內(nèi),探討其對延緩椎間盤退變的實際療效。結果:髓核細胞被轉染過表達HO-1慢病毒后,細胞免疫熒光,western blot和RT-PCR實驗提示II型膠原(COL2)和聚蛋白多糖(AGG)的表達水平明顯增加,而MMP-3和MMP-13表達明顯下降。而給予自噬抑制劑3-MA處理后,髓核細胞II型膠原(COL2)和聚蛋白多糖(AGG)的表達水平明顯降低,而MMP-3和MMP-13表達明顯增加。提示HO-1誘導自噬在椎間盤退變中起保護作用。最后兔椎間盤退變模型體內(nèi)實驗表明,HO-1能夠促進髓核細胞的自噬水平,同時緩解椎間盤的衰老,從而抑制椎間盤的退變。結論:HO-1誘導的自噬抑制髓核細胞的退變
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R681.5
【部分圖文】：

5.附圖自噬是一種廣泛存在于真核細胞中特有的,具有高度保守性的一種溶酶體依賴性降解代謝途徑,其主要的生理功能是參與受損的或者變性的蛋白質(zhì)和細胞器清除,可以循環(huán)再利用細胞內(nèi)的大分子物質(zhì),并且在調(diào)控細胞衰老的各種生理病理過程中也發(fā)揮重要的作用,且在維持細胞內(nèi)環(huán)境及自我穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[1-6]。自噬的過程主要可以分為4個階段:(1)隔離膜的產(chǎn)生;(2)自噬泡的延伸與自噬體的形成;(3)自噬溶酶體的形成;(4)自噬溶酶體的降解。然后根據(jù)細胞內(nèi)底物進入溶酶體的方式不同,將自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。我們通常所說的自噬即為巨自噬,而巨自噬根據(jù)其降解對象的選擇性,又可將其分為非選擇性自噬(即一般自噬)和選擇性自噬。其中選擇性自噬主要包括CVT途徑、過氧化物酶體自噬和線粒體自噬等。線粒體自噬是一種選擇性自噬,能夠清除受損的線粒體,具有維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要作用。目前許多的研究報道線粒體功能障礙被認為是細胞衰老的主要因素之一[7,8]。因此我們猜測線粒體自噬可能參與到髓核細胞的衰老的過程中,并且具體機制還不是非常清楚。

HO-1在衰老的髓核細胞中表達下降

HO-1過表達降低了人NP細胞的復制衰老
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本文編號：2879359