本文關(guān)鍵詞：Spag6基因敲除對(duì)小鼠內(nèi)耳和中耳的影響及相關(guān)機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因敲除致小鼠內(nèi)耳極性缺陷和聽力損失目的Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因編碼中心微管蛋白,對(duì)纖毛和鞭毛的運(yùn)動(dòng)十分重要。最近研究發(fā)現(xiàn),Spag6對(duì)纖毛的發(fā)生、調(diào)節(jié)纖毛小根的排列方向和細(xì)胞的平面極性十分重要。內(nèi)耳聽覺上皮具有聽覺形成所需要的獨(dú)特結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)最典型的平面極性,然而,Spag6在內(nèi)耳是否有作用目前尚未見報(bào)道。本研究使用Spag6基因敲除小鼠探究Spag6在小鼠內(nèi)耳中的作用。方法1.聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)和耳蝸微音電位(cochlear microphonics, CM)分別檢測(cè)同窩Spag6+/+和Spag6-/小鼠的聽力。ABR使用click聲和短純音分別進(jìn)行刺激；CM使用click聲進(jìn)行刺激,記錄結(jié)果。2.對(duì)內(nèi)耳基底膜進(jìn)行鋪片及免疫熒光染色,顯示毛細(xì)胞表皮板下的微管系統(tǒng),觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的微管系統(tǒng)有無不同。3.對(duì)出生1天的同窩Spag6+/+和Spag6-/-小鼠耳蝸基底膜進(jìn)行鋪片,行免疫熒光染色,觀察核心極性蛋白FZD6的分布有無不同。4.對(duì)內(nèi)耳基底膜進(jìn)行鋪片及免疫熒光染色,觀察Spag6+/+和.Spag6-/-小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的形態(tài)和極性,并對(duì)纖毛束的偏移角度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。5.內(nèi)耳基底膜行免疫熒光染色和掃描電鏡,觀察Spag6+/+和.Spag6-/-小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的一對(duì)中心粒、動(dòng)纖毛和纖毛束三者之間的位置關(guān)系,并對(duì)動(dòng)纖毛相對(duì)于纖毛束的偏移角度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果1.Spag6+/+小鼠聽力結(jié)果：ABR的click聲刺激反應(yīng)平均閾值為30.00±2.21 dB,ABR純音刺激4k.8k.16k.32kHz的聽力閾值分別為63.33±2.20、37.78±2.78、32.22±2.78和72.22±1.47dB,CM平均閾值40±4.08dB；spag6-/-小鼠聽力結(jié)果：ABR的click聲刺激反應(yīng)平均閾值70.71±4.14 dB,ABR純音4k.8k.16k.32kHz的聽力閾值分別為85.71±2.29、74.29±2.97、72.86±3.60和90dB,三只純合小鼠CM在80dB均無法引出。Spag6+/+小鼠和Spag6-/-小鼠的ABR及CM結(jié)果均具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.Spag6+/+小鼠毛細(xì)胞表皮板的微管系統(tǒng),以中心粒和動(dòng)纖毛為中心,向細(xì)胞質(zhì)放射狀排列。而Spag6-/-小鼠毛細(xì)胞表皮板的微管系統(tǒng)發(fā)生了改變,微管排列錯(cuò)亂,并隨動(dòng)纖毛和中心粒的移位發(fā)生了偏移。3. Spag6+/+j小鼠的核心極性蛋白FZD6呈極性分布：；而Spag6-/-小鼠FZD6蛋白分布失去極性,在細(xì)胞膜上隨機(jī)分布。4.Spag6+/+小鼠基底膜毛細(xì)胞的一排內(nèi)毛細(xì)胞和三排外毛細(xì)胞排列整齊,“八”字形纖毛束開口方向朝向內(nèi)側(cè),即耳蝸神經(jīng)的方向；耳蝸基底膜寬度由頂轉(zhuǎn)向底轉(zhuǎn)變窄。而Spag6-/-小鼠的毛細(xì)胞大量積聚在耳蝸的頂轉(zhuǎn)區(qū)域,聽覺上皮區(qū)域明顯變寬；同時(shí)Spag6-/-小鼠毛細(xì)胞纖毛的極性發(fā)生了很大偏移,表現(xiàn)為方向各異。5.Spag6+/+小鼠的一對(duì)中心粒所在直線與組織極性軸平行,動(dòng)纖毛位于纖毛束“八”字形的頂點(diǎn)。而Spag6-/-小鼠的一對(duì)中心粒所在的直線不再與組織極性軸平行,動(dòng)纖毛與纖毛束的相對(duì)位置關(guān)系發(fā)生改變。結(jié)論Spag6基因缺失可使小鼠聽力損失,這種作用可能是通過參與調(diào)節(jié)小鼠內(nèi)耳聽覺上皮的平面極性實(shí)現(xiàn)的。第二部分Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因敲除導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)中耳炎目的Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因編碼中心微管蛋白,對(duì)纖毛和鞭毛的運(yùn)動(dòng)十分重要。最近研究發(fā)現(xiàn),.Spag6對(duì)纖毛的發(fā)生、纖毛小根排列的方向和平面細(xì)胞極性的調(diào)節(jié)十分重要。極性排列的纖毛對(duì)中耳的正常功能具有重要意義,可以抵御細(xì)菌感染和清除中耳分泌物；纖毛結(jié)構(gòu)或功能異�？蓪�(dǎo)致中耳炎。然而,Spag6基因?qū)τ谥卸淖饔弥两裎匆妶?bào)道。本研究利用Spag6基因敲除小鼠,探討Spag6基因缺失對(duì)小鼠中耳的影響。方法1. RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)Spag6在Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳的表達(dá)。2.耳鏡觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的鼓膜和中耳腔,制作HE切片染色判斷中耳炎的發(fā)生情況。3.灌注固定后取Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳及咽鼓管的纖毛上皮,使用掃描電鏡觀察纖毛情況。4.透射電鏡觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳及咽鼓管的纖毛小根及一對(duì)中心微管的方向。5.對(duì)Spag6+/+和Spag6+/-小鼠的中耳粘膜上皮進(jìn)行鋪片和免疫熒光染色,觀察核心極性蛋白FZD6的分布情況。6.分別使用細(xì)菌培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)、PCR鑒定、粘液卡紅染色、Realtime-PCR、咽鼓管角度測(cè)量的方法,分別觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳的細(xì)菌情況、杯狀細(xì)胞的分布情況、粘液因子Mucin5ac和Mucin5b的表達(dá)情況以及咽鼓管角度是否異常。結(jié)果1. RT-PCR和免疫熒光染色結(jié)果顯示：Spag6在Spag6+/+小鼠中耳和咽鼓管的纖毛上皮有表達(dá)且表達(dá)于纖毛；RT-PCR和免疫熒光均未檢測(cè)到Spag6基因在Spag6-/-小鼠的中耳或咽鼓管有表達(dá)。2.耳鏡顯示1月齡Spag6+/-小鼠鼓膜完好光滑,光錐明顯,中耳腔未見異常；而同窩Spag6-/-小鼠透過鼓膜可見氣泡及積液；HE切片染色顯示Spag6-/-小鼠中耳腔及咽鼓管內(nèi)有滲出液體和炎性細(xì)胞,6月齡小鼠出現(xiàn)鼓室硬化,同窩Spag6+/+小鼠鼓室腔未見明顯異常。3.掃描電鏡顯示生后25天Spag6-/-小鼠的鼓室上皮纖毛出現(xiàn)倒伏錯(cuò)亂,部分區(qū)域稀疏；而野生型小鼠纖毛密度未見降低,纖毛方向一致；Spag6-/-小鼠的骨岬的纖毛已經(jīng)喪失,而Spag6+/+小鼠仍然存在。4.透射電鏡顯示Spag6-/-小鼠中耳上皮的纖毛小根方向錯(cuò)亂,纖毛的一對(duì)中心微管所在直線方向不一致；而Spag6+/+小鼠纖毛小根的方向一致,所有纖毛的一對(duì)中心微管所在直線平行,基本指向同一方向。5.免疫熒光染色顯示FZD6蛋白在Spag6+/+小鼠中耳的纖毛上皮細(xì)胞的胞膜上呈極性分布,而FZD6蛋白在Spag6-/-小鼠的分布則失去極性。6.細(xì)菌培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)和使用PCR鑒定小鼠中耳鼓室細(xì)菌顯示,Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳腔中均存在卡他莫拉菌,且菌落數(shù)量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；粘液卡紅染色顯示Spag6-/-小鼠的杯狀細(xì)胞較Spag6+/+小鼠未見明顯增多；realtime-PCR顯示粘液因子Mucin5ac和Mucin5b的mRNA在Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳表達(dá)無明顯差異；咽鼓管角度測(cè)量顯示Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的咽鼓管角度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論Spag6基因缺陷可導(dǎo)致Spag6-/-小鼠出現(xiàn)中耳炎,這可能是由于中耳上皮纖毛的結(jié)構(gòu)和擺動(dòng)方向出現(xiàn)異常；而纖毛結(jié)構(gòu)和擺動(dòng)方向異�？赡苁怯捎赟pag6基因參與了中耳上皮極性的調(diào)節(jié)和Spag6缺失影響了這種極性調(diào)節(jié)所致。
【關(guān)鍵詞】：精子相關(guān)抗原6 聽力 毛細(xì)胞 平面細(xì)胞極性 內(nèi)耳 精子相關(guān)抗原6 中耳 咽鼓管 平面細(xì)胞極性 中耳炎
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R764
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 符號(hào)說明16-17
• 前言17-21
• 第一部分：Sperm-Associated Antigen 6(Spag6)基因敲除致小鼠內(nèi)耳極性缺陷和聽力損失21-32
• 研究背景21-22
• 材料方法22-25
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-30
• 討論30-31
• 結(jié)論31-32
• 第二部分：Sperm-Associated Antigen 6(Spag6)基因敲除導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)中耳炎32-50
• 研究背景32-33
• 材料方法33-39
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-48
• 討論48-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-57
• 致謝57-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文58-59
• 英文附文一59-78
• 英文附文二78-101
• 附件101

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本文編號(hào)：287758