本文關鍵詞：白細胞介素-18及相關標志物在深靜脈血栓形成中的表達變化與作用機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：課題研究主要就白細胞介素-18、核轉(zhuǎn)錄因子-κB、血管性血友病因子等標志物,在深靜脈血栓形成中的作用及相互關系進行實驗研究。通過動物造模實驗、臨床檢測及細胞實驗等方式,結合分子生物學實驗技術手段,就上述關鍵標志物與深靜脈血栓形成的相關機理進行探討。目的：1、狹窄法進行瘀滯型SD大鼠下腔靜脈血栓造模,分組對比不同時間點大鼠下腔靜脈血栓形成情況,檢測IL-18、NF-κB、vWFGPIb-α等標志物的表達狀態(tài)；同時在臨床患者血液中檢測上述指標的變化。結合探討研究所關注檢測指標與DVT的臨床聯(lián)系及意義;2、體外構建有效的IL-18慢病毒過表達載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制載體,作用HUVECs提取總RNA進行基因芯片分析,觀察HUVECs整體功能變化；大鼠尾靜脈注謝IL-18過表達／抑制質(zhì)粒載體病毒并行IVC血栓造模,比較血栓形成情況,檢測局部靜脈壁IL-18及相關指標的表達變化,進一步討論過表達／抑制IL-18對血栓形成和下游標志物的影響；3、針對IL-18與內(nèi)皮細胞功能障礙標志物間的關聯(lián)性進行實驗,深入探討IL-18影響內(nèi)皮細胞功能的作用途徑,以及該途徑對靜脈血栓形成造成影響的機理。方法：1、120只SPF級SD大鼠,按隨機分組原則分為3組：DVT模型組(n=40)、假手術組(n=40)和對照組(n=40),參考課題組歷年研究經(jīng)驗和經(jīng)典文獻報道,在造模后設立2h、8h、24h、72h等不同時間點。每個時間點每組分別取10只大鼠進行解剖對照觀察血栓形成情況,ELISA檢測血液樣本中IL-18、NF-κB、vWF和GPIb-α的表達情況；2、采集篩選臨床血樣,分為深靜脈血栓組患者30例、實驗對照組患者20例、正常對照組20例,ELISA檢測血中IL-18、NF-κB、vWF 和 GPIb-α的表達,對照動物造模結果進行初步探討；3、構建人和大鼠IL-18慢病毒過表達載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制載體,real-time PCR、Western blot等方法對過表達／抑制效率進行檢測；提取IL-18過表達／抑制后HUVECs的總RNA進行基因芯片分析,觀察過表達／抑制IL-18對靜脈內(nèi)皮細胞正常功能的影響；4、將兩種載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞293T后所產(chǎn)生的病毒,分別通過大鼠尾靜脈注射的方式對實驗動物進行分組預處理；大鼠DVT造模后對IVC血栓段組織進行取材,對血栓形成情況進行對比,real-time PCR、Western blot檢測靜脈壁組織中IL-18及相關基因的表達變化；5、體外培養(yǎng)HUVECs并添加外源性IL-18進行預處理,通過real-time PCR、 Western blot、免疫熒光、流式細胞儀等手段,檢測IL-18是否通過激活NF-κB介導的細胞信號通路,對HUVECs存活狀態(tài)和vWF、P-selectin、t-PA等內(nèi)皮細胞功能標記物表達產(chǎn)生影響,結合前期實驗結果對DVT發(fā)生機理進行綜合分析。結果：1、利用狹窄法可成功制作瘀滯型SD大鼠IVC血栓模型,狹窄法殘余管腔橫截面積比控制在10%左右可得到良好成栓率、成活率;造模后8h開始有完全性血栓形成,24h血栓形成穩(wěn)定；2、IL-18、NF-κB、vWF和GPIb-α等ELISA檢測結果示：大鼠造模后血中蛋白檢測隨血栓的發(fā)生、發(fā)展逐漸呈現(xiàn)高表達,24h(病檢顯示為血栓形成高峰期)各指標明顯上調(diào)(P0.05)；臨床下肢深靜脈血栓患者,血液中相關蛋白表達高于無DVT的健康人和血栓高危因素患者(P0.05),各指標表達基本符合動物造模表達情況；3、利用慢病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,可成功構建高效的IL-18基因過表達／抑制載體；基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)IL-18過表達可對HUVECs正常生理功能產(chǎn)生明顯影響,并出現(xiàn)大量的差異表達基因；而抑制IL-18表達可產(chǎn)生不同效應；4、IL-18過表達慢病毒和IL-18抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒,預處理大鼠行DVT造模后各組血栓形成的重量、質(zhì)量和重量／質(zhì)量比等指標,均顯示IL-18的表達變化對深靜脈血栓形成有明顯影響(P0.05)；造模段靜脈組織中NF-κB和vWF的基因和蛋白表達水平,均隨IL-18表達變化出現(xiàn)調(diào)控性改變；5、IL-18可激活HUVECs中NF-κB介導的細胞信號轉(zhuǎn)導通路,使HUVECs損傷及早期凋亡現(xiàn)象明顯增多；促使內(nèi)皮細胞標志物vWF、P-selectin發(fā)生表達上調(diào)、t-PA合成產(chǎn)生量明顯減少。結論：1、炎性反應和內(nèi)皮細胞功能相關標志物：IL-18、NF-κB、vWF、P-selectin、t-PA與深靜脈血栓形成的發(fā)生、發(fā)展過程相關；2、IL-18高表達可使]HUVECs存活狀態(tài)及凋亡異常,選擇性抑制NF-κB激活可明顯減少該途徑所致的細胞損傷；3、IL-18介導內(nèi)皮損傷可促使vWF、P-selectin表達上調(diào)、t-PA合成量明顯減少,導致靜脈易栓性；4、IL-18調(diào)控NF-κB引起的內(nèi)皮細胞炎性損傷和功能異常,可能是深靜脈血栓形成的相關機理之一。
【關鍵詞】：白細胞介素18 核轉(zhuǎn)錄因子κB 血管性血友病因子 血小板膜糖蛋白Ibα 深靜脈血栓形成 靜脈內(nèi)皮細胞 炎癥反應
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.6
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 中英文符號說明13-17
• 前言17-19
• 第一部分：深靜脈血栓形成中IL-18及相關標志物的表達及意義19-69
• 研究一 大鼠深靜脈血栓模型IL-18、NF-κB、vWF及GPIb-α的表達變化19-45
• 一、材料和方法19-37
• 二、結果37-45
• 研究二 下肢深靜脈血栓患者IL-18等標志物的表達與意義45-59
• 一、研究對象和方法45-54
• 二、結果54-59
• 討論59-68
• 結論68-69
• 第二部分：過表達/抑制白介素-18在深靜脈血栓形成中的作用69-129
• 研究一 IL-18過表達/抑制載體構建及對靜脈內(nèi)皮細胞的功能影響69-106
• 1 實驗設備及材料69-72
• 2 實驗方法72-86
• 3.結果86-106
• 研究二 過表達/抑制IL-18對大鼠深靜脈血栓形成的影響106-122
• 1.實驗設備及材料106
• 2.實驗方法106-115
• 3.結果115-122
• 討論122-128
• 結論128-129
• 第三部分：IL-18激活NF-κB影響細胞信號轉(zhuǎn)導對靜脈內(nèi)皮細胞的作用129-154
• 1 實驗材料及設備129-130
• 2 實驗方法及步驟130-137
• 3 結果137-148
• 討論148-153
• 結論153-154
• 參考文獻154-163
• 附錄-1163-165
• 附錄-2165-166
• 附錄-3166-176
• 論文相關綜述176-185
• 參考文獻181-185
• 攻讀學位期間基本情況185-186
• 致謝186

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張鵬;施海彬;劉圣;李麟蓀;;犬下肢深靜脈血栓模型的實驗研究[J];介入放射學雜志;2006年05期

  本文關鍵詞：白細胞介素-18及相關標志物在深靜脈血栓形成中的表達變化與作用機理研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：287416