腰背痛是臨床上常見疾病,成年人中有腰背痛經(jīng)歷的可高達80%,這不僅給患者的生活和工作帶來影響,也給家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)。目前多項研究表明椎間盤退變與腰背痛關(guān)系密切,是引起腰背痛的重要原因。雖然臨床上有多種治療手段可以緩解腰背痛,但目前各種措施都不能從根本上阻斷或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。為了解決這一大臨床難題,多年來研究者力圖探索出有效的生物學(xué)治療方式來達到修復(fù)或再生椎間盤的目的,從而能從根本上避免退變性椎間盤疾病的發(fā)生。椎間盤退變的生物學(xué)治療措施包括生長因子注射治療、細胞治療、組織工程材料植入、基因治療等。其中,生長因子治療開展較早、應(yīng)用廣泛,是目前修復(fù)或再生椎間盤退變的有效治療策略。相比于其它幾種治療方法,生長因子療法操作更方便,技術(shù)難度小,更適合于臨床大規(guī)模應(yīng)用,具有廣闊的研究前景�，F(xiàn)已知多種生長因子可以刺激椎間盤內(nèi)細胞增生、抑制細胞凋亡、刺激細胞外基質(zhì)合成等等,可對椎間盤退變產(chǎn)生修復(fù)作用,但同時也發(fā)現(xiàn),向椎間盤內(nèi)注射單一的生長因子,它所能發(fā)揮的修復(fù)作用非常有限。為了增加生長因子的作用效果和持續(xù)時間,研究者曾嘗試將多種生長因子聯(lián)合應(yīng)用,證實其修復(fù)作用可以得到增強。而富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)制品作為來源于自體的活性物質(zhì),富含各種活性因子,其中多種生長因子具有刺激細胞增殖、增強細胞功能、抑制細胞凋亡等功能,可以改善椎間盤內(nèi)環(huán)境�；诖吮尘�,本研究探索利用自體富血小板血漿釋放物(platelet-rich plasma releasate,PRPr)對退變椎間盤的作用效果,以期建立一種可有效修復(fù)或再生退變椎間盤的治療方式。第一部分兔腰椎間盤退變模型的建立和評估研究背景椎間盤退變與腰背痛發(fā)病關(guān)系密切,探索椎間盤退變的發(fā)生及發(fā)展機制,尋求高效、安全、經(jīng)濟的治療方式顯得尤為關(guān)鍵。而動物模型是探索疾病發(fā)病機制和驗證治療效果的重要工具,尤其是在臨床前期研究中起著不可替代的作用。目前退變椎間盤的造模方法大致可分為自發(fā)退變和實驗誘導(dǎo)兩大類。本研究最終目的是探索PRPr對退變椎間盤的修復(fù)作用,由于PRPr中富含多種生長因子,潛在修復(fù)能力較強,因此本實驗選用可誘導(dǎo)出中重度退變的髓核抽吸造模方式,力圖模擬人中晚期椎間盤退變過程和表現(xiàn),為后續(xù)治療性研究做實驗準(zhǔn)備。目的本部分實驗探索通過髓核抽吸法來建立一種可靠的、能模擬人椎間盤退變的動物模型,并對其退變表現(xiàn)建立評估體系,為后續(xù)治療性研究做實驗準(zhǔn)備。方法選用36只健康新西蘭大白兔,隨機分為實驗組和對照組各18只。實驗組用連接10ml注射器的21G針頭穿刺進入L4/5、L5/6、L6/7椎間盤內(nèi),穿刺深度控制在5mm左右,抽取少量髓核組織,其質(zhì)量在5～8mg之間。操作結(jié)束后,逐層縫合。對照組僅切開顯露出椎間盤,不進行穿刺或髓核吸取等操作。兩組動物分別于術(shù)前、術(shù)后1w、2w、4w拍攝腰椎X線片,測量椎間盤高度(Disc Height Index,DHI),計算DHI%表示造模前后椎間盤高度的變化。于術(shù)后1w、2w、4w取材后做HE、番紅、Masson三色染色,依據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)對椎間盤組織形態(tài)變化評分;采取ELISA法來測定椎間盤內(nèi)聚集蛋白聚糖(aggrecan,AGC)和Ⅱ型膠原蛋白(Collagen type Ⅱ,COL Ⅱ)的含量。結(jié)果X線結(jié)果顯示實驗組DHI%在術(shù)后1w即下降至82.5 7%±6.56%,術(shù)后2w和4w分別為80.29%±6.19%和73.25%±8.14%。并且實驗組DHI%下降呈逐漸加重的表現(xiàn)。組織切片染色發(fā)現(xiàn),實驗組椎間盤髓核皺縮、纖維環(huán)排列紊亂或出現(xiàn)裂隙、髓核內(nèi)細胞數(shù)量減少、細胞外基質(zhì)減少、出現(xiàn)細胞化生。組織學(xué)評分結(jié)果顯示在造模后1w、2w、4w,實驗組的組織學(xué)評分均出現(xiàn)增高,且隨時間延長,實驗組椎間盤退變程度逐漸加重。ELISA檢測結(jié)果顯示椎間盤在造模后1w、2w和4w,實驗組AGC含量(43.62±4.97ng/g、38.50±5.36ng/g、31.16± 6.95ng/g)和 COL Ⅱ含量(70.42±6.93ng/g、64.99±6.84ng/g、5 5.49±6.2 3 ng/g)均較對照組明顯減少,并且實驗組二者含量減少呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢。結(jié)論本研究結(jié)果表明髓核抽吸法順利誘導(dǎo)出了兔腰椎間盤退變,術(shù)后觀察發(fā)現(xiàn)造模后椎間盤高度下降、出現(xiàn)椎間盤退變組織學(xué)特征、椎間盤內(nèi)AGC和COLⅡ含量下降,且上述表現(xiàn)持續(xù)存在,證明髓核抽吸操作可成功建立兔腰椎間盤退變模型,此動物模型可應(yīng)用于退變椎間盤的治療性研究中。第二部分自體富血小板血漿釋放物的制備和活性評價研究背景PRP是將血液通過梯度離心等方式分離得到的濃縮產(chǎn)物,其特點是含有高濃度的血小板。作為一種自體來源的生物制劑,PRP已被證實具有促進組織修復(fù)和再生的功能。其發(fā)揮生物學(xué)修復(fù)作用的前提是被凝血酶、氯化鈣等激活物激活,將含有的各種生長因子釋放出來。但是激活后PRP立即轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀,不利于注射治療。PRPr是從激活PRP中提取出來的含有多種生長因子的混合物,它呈現(xiàn)為液體狀態(tài),因此可用于椎間盤內(nèi)注射用。目的本研究即通過三步離心法提取兔PRPr,并對其活性進行測定,為下一步實驗做準(zhǔn)備。方法選取10只新西蘭大白兔。于兔耳中央動脈采取新鮮血液14ml,注射器內(nèi)已抽取1ml枸櫞酸鹽以防止發(fā)生凝血。將抽取的全血分為三部分:分別取2ml用于測定全血血小板濃度和全血TGF-β 1濃度,剩余置于離心管內(nèi)制備PRPr。將全血于250g離心10分鐘,吸取全部血漿層、白膜層、白膜層與紅細胞層交界面以下約2mm處血液成分至另一離心管內(nèi)。再以1000g進行第二次離心10分鐘,去除3/4上清液,保留下方濃縮的血小板和上方剩余的部分血漿,混勻后取約0.2ml PRP進行血小板計數(shù)。接下來,向每1ml PRP中加入100μL激活劑(1000U/mL凝血酶和100mM CaCl2),搖勻,從而激活血小板獲得凝膠狀的激活后PRP,靜置3小時,將此凝膠狀物1000g離心10分鐘,再收集上清液,獲取PRPr。利用血細胞分析儀測定全血和未激活PRP中血小板濃度。使用ELISA法測定全血和PRPr中TGF-β 1的濃度。結(jié)果正常兔全血中血小板計數(shù)為(217.40±51.86)×109/L,PRP中血小板計數(shù)為(991.30±107.76)×109/L。血小板回收率為66.80%±11.76%,富集系數(shù)為4.72±0.89。本制備方式獲取的PRP血小板濃度為正常全血的4.7倍左右。正常兔全血中TGF-β 1濃度為297.86±70.66 ng/L,PRPr中TGF-β 1濃度為 1020.95±219.08 ng/L,為全血的 3.57±0.98 倍。對 PRPr 中 TGF-β1 濃度和其它指標(biāo)進行相關(guān)性分析,統(tǒng)計結(jié)果表明全血血小板計數(shù)和未激活PRP血小板計數(shù)與之呈顯著正相關(guān)。結(jié)論通過三次離心法可以制備出含有高濃度的TGF-β1的PRPr,可滿足動物實驗或臨床應(yīng)用的要求。PRPr中TGF-ββ1濃度與全血血小板計數(shù)或PRP血小板計數(shù)呈明顯正相關(guān)關(guān)系,提高PRP中血小板含量有助于獲取更高活性的PRPr。第三部分自體富血細胞血漿釋放物對兔退變椎間盤的干預(yù)作用研究背景目前椎間盤退變性疾病治療分為保守治療和手術(shù)治療兩大類,但目前的治療措施都只能緩解患者的疼痛癥狀,并不能阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。目前比較有潛力的修復(fù)措施是采用各種生物制劑,其中就包括各種PRP制品。研究表明PRP對骨缺損、關(guān)節(jié)軟骨退變或損傷、韌帶損傷、半月板損傷、肌腱、軟組織缺損等均具備一定修復(fù)功能。體外實驗表明,PRP可有效促進動物椎間盤細胞增殖和細胞外基質(zhì)代謝。實際臨床工作中,常遇到椎間盤嚴(yán)重退變的情況,其生物學(xué)治療更加困難。而髓核抽吸法建立的退變模型能模擬出中重度椎間盤退變的情況。注射PRP釋放物是否對中重度的椎間盤退變也有修復(fù)效果,目前還缺乏這方面研究。目的本研究采取髓核抽吸法建立兔椎間盤中重度退變模型,然后向椎間盤內(nèi)注射PRPr和TGF-β1,通過影像學(xué)、組織學(xué)、免疫學(xué)測定等手段來評估PRPr對退變椎間盤的修復(fù)效果,同時對PRPr和TGF-β1的修復(fù)效果進行比較,以探索更佳的治療方式。方法72只新西蘭大白兔分為4組:PRPr組、TGF-β 1組、PBS組和Sham組(n=18)。通過髓核抽吸法來建立兔椎間盤退變模型,造模2w后再次手術(shù),向退變椎間盤內(nèi)注射干預(yù)劑。前三組分別注射20μL的PRPr、TGF-β 1(1ng/ml)和PBS。Sham組僅進行顯露和穿刺,不注射任何藥物。在注射前和注射術(shù)后1w、2w、4w行腰椎X線檢查,測量DHI%以表示椎間盤高度變化。術(shù)后1w、2w、4w處死取材,行HE、番紅O、Masson染色以便組織學(xué)觀察,同時通過ELISA法測定椎間盤內(nèi)AGC及COL Ⅱ含量。結(jié)果造模術(shù)后2w,4組椎間盤高度DHI%出現(xiàn)明顯下降,下降幅度均在20%左右,4組之間DHI%無明顯差異。二次手術(shù)后2w,相比于PBS組或Sham組,PRPr 組或 TGF-β1 組的 DHI%均明顯增加(PRPr 組:88.98±2.97%,TGF-β1組:84.32±3.43%),并且DHI%的增加一直持續(xù)到注射后4w(PRPr組:92.15±3.1 1%,TGF-β1 組:86.99±4.94%)。進一步分析得知,PRPr 組 DHI%的提高程度要比TGF-β1組明顯。分析不同時間點之間DHI%的區(qū)別,顯示PRPr組在注射后4w DHI%要比注射后2w時進一步增加,但是TGF-β1組各時間點DHI%卻無明顯變化。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示,當(dāng)向退變椎間盤內(nèi)注射PRPr或TGF-β1后退變得以不同程度的修復(fù),兩組退變椎間盤均有再生表現(xiàn)。髓核逐漸恢復(fù)成接近圓形,并且內(nèi)部逐漸再次出現(xiàn)較大、含濾泡的細胞。番紅O染色結(jié)果顯示髓核內(nèi)蛋白多糖含量增加,纖維環(huán)內(nèi)成簇狀的軟骨樣細胞增多,并且纖維環(huán)內(nèi)膠原纖維的分布變得較前重新有規(guī)則。組織學(xué)評分結(jié)果表明PRPr組的組織學(xué)評分最早在注射后2w開始出現(xiàn)下降,至術(shù)后4w其評分進一步下降。而TGF-β1組的組織學(xué)評分僅在術(shù)后4w時評分下降才有統(tǒng)計學(xué)意義。PRPr組與TGF-β1組相比,在注射后2w和4w組織學(xué)評分均更低。ELISA結(jié)果證實了 PRPr或TGF-β1具有促進退變椎間盤AGC和COLⅡ合成的作用。注射后1w,與PBS組或Sham組相比,PRPr組AGC和COLⅡ含量均有增加。隨著時間延長,至術(shù)后2w和4w,其含量增加繼續(xù)有統(tǒng)計學(xué)意義。TGF-β 1組在術(shù)后1wAGC含量開始增加,但COL Ⅱ含量增加卻延遲至術(shù)后2w。結(jié)果還顯示PRPr組內(nèi)AGC和COL Ⅱ含量從術(shù)后2w開始比TGF-β1組更高,并持續(xù)到術(shù)后4w。對同一組內(nèi)不同時間點AGC和COL Ⅱ含量進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示PRPr組在術(shù)后4w含量呈逐漸增加趨勢。但TGF-β1組在術(shù)后3個時間點的含量無明顯差別。而PBS組和Sham組AGC和COL Ⅱ含量均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。結(jié)論本研究證實PRPr對退變椎間盤具有修復(fù)和再生作用。在髓核抽吸誘發(fā)的兔中重度椎間盤退變模型中,將PRPr注射入退變椎間盤后,椎間盤高度、組織學(xué)形態(tài)、細胞數(shù)量、細胞外基質(zhì)含量等均被證實明顯改善。并且,PRPr對兔退變椎間盤的修復(fù)效果在作用強度和持續(xù)時間上均優(yōu)于單獨注射TGF-β1,這提示PRPr內(nèi)多種生長因子共同對退變椎間盤發(fā)揮了修復(fù)作用。PRPr具有安全性高、制備方便、效果強的優(yōu)勢,為將來臨床上治療DDD提供了一種有力選擇。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R681.5
【部分圖文】：

圖２－ｌ?ＰＲＰｒ的制備過程

?山東大學(xué)博士學(xué)位論文???明顯正相關(guān)，但是ＰＲＰｒ中ＴＧＦ－Ｐ１濃度和全血ＴＧＦ－Ｐ１濃度、血小板回收??率或富集系數(shù)之間無相關(guān)關(guān)系。??對ＰＲＰ和全血的血小板計數(shù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)??（ｒ＝０．７４６，Ｐ＝０．０丨３）。對血小板回收率和富集系數(shù)之間進行相關(guān)性分析，結(jié)??果顯示二者呈正相關(guān)（ｒ＝０．６４９，?Ｐ＝０．０４２）。??表２－３?ＰＲＰｒ中ＴＧＦ－Ｐ?１濃度和其它指標(biāo)的相關(guān)性分析??ｒ?ｒ??令血丨［ＩＩ?小?Ｗ?ＵＳ?０．８１３?０００４??ＰＲＰ?血小擬?ｉＫ＆?０．７８０?０?００８??令血?ＴＧＦ－［Ｍ?濃?Ｕ?０．２４９?０?４８９??血小板冋收卞？?０．４５５?０．１８７??ｆｆｌＬ小板這鏘系數(shù)?０．４７５?０．１６５??４００－．??％?？??Ｉ?３００－??ｌ２〇〇－?卜０．８１３??Ｐ?＝０．００４??＜＋１?？??１００■??Ｉ?ｉ?＼?ｉ?Ｉ??６００?８００?１０００?１２００?１４００?１６００??ＴＧＦ－ｐ?１（ｐｇ／ｍｌ）??圖２－２?ＰＲＰｒ中ＴＧＦ－Ｐ?Ｉ濃度與全血血小板計數(shù)的相關(guān)性分析。結(jié)果表??明二者呈顯著正相關(guān)關(guān)系，ＰＲＰｒ中ＴＧＦ－Ｐ１濃度隨全血血小板計數(shù)增高而??增加。??５７??

?山東大學(xué)博士學(xué)位論文???１３００－．??ＩＴ?？??１２００－?＾??！?／??栽?１１００－?？??｜?１０００－?ｒ?＝０．７８０??１?Ｖ／?？?Ｆ＝０．００８??＆?９００－?？??〇．?？??８００－１?１?１?１??５００?１０００?１５００?２０００??ＴＧＦ－ｐ?１（ｐｇ／ｍｌ）??圖２－３?ＰＲＰｉ？中ＴＧＦ－Ｐ?Ｉ濃度與ＰＲＰ血小板計數(shù)進行相關(guān)性分析，結(jié)??果表明呈正相關(guān)。結(jié)果表明二者呈顯著正相關(guān)關(guān)系，ＰＲＰｒ中ＴＧＦ－Ｐ１濃度??隨ＰＲＰ血小板計數(shù)增高而增加。??５８??
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