第一部分川崎病B10細胞數(shù)量及功能的研究背景:川崎病(KD)是一種兒童急性系統(tǒng)性血管炎癥,已發(fā)現(xiàn)單核細胞過度活化是其發(fā)病的重要環(huán)節(jié),但具體機制尚未完全闡明。調節(jié)性B細胞(Bregs)是一類不依賴分泌免疫球蛋白且具有免疫調節(jié)功能的B細胞,IL-10對于其發(fā)揮負性調節(jié)作用必不可少,故以功能命名為“B10”細胞。研究已發(fā)現(xiàn)B10細胞在多種疾病發(fā)病機制中扮演重要角色,但在川崎病中的作用卻尚未完全闡明。目的:本研究通過檢測KD患者急性和緩解期B細胞不同亞群IL-10表達,分析疾病不同階段B細胞分化為B10的能力,并進一步評估B10細胞對單核細胞功能的抑制作用,旨在探索川崎病負調控異常的原因,初步闡明單核細胞過度活化的發(fā)病機制。方法:選取深圳市兒童醫(yī)院住院KD患兒23例,根據(jù)有無冠狀動脈損害分為有冠狀動脈損害組(KD~(CAL+))和無冠狀動脈損害組(KD~(CAL-))。同年齡健康兒童33例為對照組(Ctrl)。流式細胞術檢測外周血總B細胞(CD19~+)、過渡B細胞(CD19~+CD24~hii CD38~(hi))、初始B細胞(CD19~+CD27~-CD24~(int)CD38~(int))和記憶B細胞(CD19~+CD24~(hi)CD27~+)胞內IL-10表達水平。免疫磁珠陰性分選CD19~+B細胞及CD14~+單核細胞。Real-time PCR檢測B細胞IL-10 mRNA表達。CpG和sCD40L體外誘導B細胞IL-10表達,再與單核吞噬細胞共培養(yǎng),流式檢測CD14~+單核細胞胞內TNF-α表達水平。通過公式[1-(共培養(yǎng)體系中單核細胞胞內TNF-α表達/單獨培養(yǎng)單核細胞內TNF-α表達)×100)]計算抑制率。采用IBM SPSS version 20.0 Windows軟件進行統(tǒng)計分析。使用Kolmogorov-Simonov檢驗來評估數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果:(1)KD患兒23例,男13例,女10例;年齡6-107月,平均(39.43±25.38)月。KD~(CAL+)13例(56.5%),KD~(CAL-)10例(43.5%),臨床表現(xiàn)主要包括:發(fā)熱持續(xù)時間7.48±1.93(5–13)天,皮疹(95.7%),淋巴結腫大(87.0%),結膜充血(100.0%),口唇粘膜病變(100.0%),關節(jié)炎(13.0%),手足脫皮(69.6%),膿尿(43.5%),黃疸(13.0%)及血小板增高(82.6%)。(2)四組B細胞群體均表達IL-10;過渡性和記憶性B細胞產生IL-10水平高于初始B細胞。(3)KD急性期,各B細胞亞群IL-10表達均呈下降趨勢,記憶B細胞中尤為明顯(P0.05)。IVIG治療后,各B細胞亞群IL-10表達部分恢復;其中總B細胞IL-10表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)與Ctrl和KD~(CAL-)組相比,KD~(CAL+)組IL-10表達降低更為明顯。(5)與Ctrl相比,KD急性期B細胞IL-10mRNA表達水平明顯下降(P0.05);IVIG治療后,其表達水平較急性期部分恢復(P=0.061)。(6)KD組患兒外周血單核細胞胞內TNF-α表達明顯高于Ctrl(P0.05);比較自體誘導B10細胞對單核細胞胞內TNF-α表達的抑制率,KD組較Ctrl組降低四倍(P0.05)。(7)分別將KD組及Ctrl組誘導B10細胞與正常兒童單核細胞進行混合培養(yǎng),與Ctrl組B10細胞混合培養(yǎng)的單核細胞胞內TNF-α水平較與KD組混合培養(yǎng)的單核細胞明顯降低(P0.05)。結論:(1)不同分化階段B細胞均有分泌IL-10的潛力,這種能力隨疾病狀態(tài)而改變;(2)以單一分化階段B細胞代表調節(jié)性B細胞并不恰當,而以IL-10等功能因子界定B細胞的免疫調節(jié)功能更為合適。(3)KD患兒急性期B10細胞數(shù)量及功能均受損,其負調節(jié)能力下降。第二部分川崎病B10細胞micro RNA調控機制研究背景:IL-10是一種關鍵負性調節(jié)細胞因子,來自多種不同細胞類型,對其表達調控一直是研究重點。最近研究表明,IL-10和mi RNAs之間存在重要相互作用。mi RNAs調控IL-10已被證實在自身免疫和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。但以上研究大多基于單核吞噬細胞和T細胞,對于B細胞IL-10表達的mi RNAs調控卻尚乏系統(tǒng)研究。目的:本項目利用具有高炎癥反應特點的KD疾病模型,對B10細胞mi RNAs調控機制進行系統(tǒng)研究,深入解析該疾病B10細胞負調控異常的原因及其與單核細胞過度炎癥反應的關系,為闡明川崎病發(fā)病機制提供新的理論基礎,以及疾病早期干預篩選新的治療靶點。方法:免疫磁珠陰性分選CD19+B細胞及CD14+單核細胞。流式檢測單核細胞胞內TNF-α蛋白表達水平。Real-time PCR檢測B細胞miRNAs表達,包括:mi R-21-3p,mi R-98-5p/3p,mi R-27a-3p,let7b-5p和mi R-142-3p/5p表達。通過多變量分析,確定IL-10表達(因變量)與mi RNAs表達(自變量)之間的關系。通過計算Pearsons(正態(tài)數(shù)據(jù)分布)或Spearmans(非正態(tài)數(shù)據(jù)分布)相關系數(shù),初步探討IL-10與mi RNAs之間可能的聯(lián)系。采用多元線性回歸分析篩選影響IL-10表達的關鍵mi RNA。應用多元逐步回歸分析確定最佳回歸方程(納入標準P0.05;排除標準P0.1)。利用RNA遞載材料PEI將Agomir-27-3p-FAM(Mimic)或Antagomir-27-3p-FAM(Inhibitor),及其相應陰性對照(NC)轉染至外周血B細胞。激光共聚焦顯微鏡檢測熒光標記mi RNAs細胞內定位,流式檢測轉染效率及胞內IL-10表達。采用Cp G+s CD40L誘導培養(yǎng)B10細胞。ELISA檢測誘導B10細胞培養(yǎng)上清IL-10表達。將轉染及誘導B10細胞與CD14+單核細胞共培養(yǎng),觀察轉染后B10細胞對單核細胞TNF-α產生的抑制作用。流式檢測單核細胞胞內IL-10表達及Real-time PCR檢測單核細胞mi R-27a-3p表達。結果:(1)KD急性期mi R-98-5p/3p、mi R-21-5p、let7b-5p、mi R-27a-3p表達均明顯高于對照組;IVIG治療后,除let7b-5p外,其余mi RNAs表達均下調(P0.05)。KDCAL+組mi R-98-5p、mi R-27a-3p表達增加更顯著,而KDCAL-組mi R-21-5p、mi R-98-3p表達增加更顯著(P0.05)。mi R-142-3p/5p在KD急性期表達水平較對照組降低(P0.05)。mi R-106a表達水平無明顯變化。(2)選取疾病不同階段表達變化差異顯著的micro RNAs作為自變量(mi R-21-3p,mi R-98-5p/3p,mi R-27a-3p,let7b-5p,mi R-142-3p/5p),IL-10作為因變量。多因素分析結果顯示:IL-10 m RNA及蛋白表達都與mi R-27a-3p表達呈負相關(r=-0.599,P0.05;r=-0.667,P0.05),但IL-10與其他mi RNAs之間無顯著相關關系。多元逐步回歸方程為IL-10=0.001-0.001×mi R-27a-3p(根據(jù)m RNA水平);IL-10=1.508-0.999×mi R-27a-3p(根據(jù)蛋白水平)。(3)激光共聚焦顯微鏡下觀察轉染B細胞,熒光主要分布在細胞質中。流式檢測顯示B細胞的mi RNA轉染率可達到(12.42%±0.94%)。(4)轉染KD患兒純化B細胞24h后,Antagomir-27a組B細胞IL-10表達顯著高于NC組(P0.05)。(5)轉染正常兒童B細胞24h后,流式及ELISA檢測Agomir-27a組和Antagomir-27a組B細胞胞內及培養(yǎng)上清IL-10表達水平,均較各自NC組明顯降低或升高(P0.05)。(6)與Agomir-27a-B10細胞組共培養(yǎng)的CD14+單核細胞TNF-α表達明顯高于與Antagomir-27a-B10細胞組共培養(yǎng)的單核細胞(P0.05)。(7)正常健康兒童外周血單核細胞與KD組或Ctrl組Antagomir-27a-B10細胞共培養(yǎng),二者混合培養(yǎng)上清IL-10濃度均較各自NC組顯著升高,而單核細胞TNF-α表達均下降(P0.05)。(8)KD急性期CD14+單核細胞IL-10表達水平高于Ctrl組;KD單核細胞mi R-27a-3p m RNA表達水平在急性期也明顯高于Ctrl組,IVIG治療后表達下降。結論:KD急性期B細胞mi R-27a-3p表達上調,可通過抑制B10細胞的負調節(jié)功能促進單核細胞介導的炎癥反應,參與KD發(fā)病。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R725.4
【部分圖文】：

根據(jù)既往文獻報道[32],本研究通過使用4個膜表面標記物(CD19、CD38、CD24和CD27)來識別不同的B細胞亞群,包括總B細胞(CD19+)、過渡B細胞(CD19+CD24hiCD38hi)、初始B細胞(CD19+CD27-CD24intCD38int)和記憶B細胞(CD19+CD24hiCD27+)(圖1-1)。細胞活性分析表明,每個B細胞亞群中存活B細胞的百分比均大于95%(圖1-2)。圖1-2流式細胞術檢測B細胞及其亞群細胞活力。

流式細胞術檢測B細胞及其亞群細胞活力。

經(jīng)流式檢測發(fā)現(xiàn),所有B細胞亞群均產生IL-10;但無論在正常情況,還是疾病狀態(tài),過渡性和記憶性B細胞產生的IL-10水平均高于初始B細胞。在KD急性期,各B細胞亞群IL-10表達均呈下降趨勢,在記憶B細胞中尤為明顯。IVIG治療后,所有B細胞亞群IL-10表達均增加,但尚未恢復至正常水平;IL-10表達水平在CD19+B細胞(總B細胞)的增加有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1-3,圖1-4A)。結果還發(fā)現(xiàn):與健康對照組和KDCAL-組相比,KDCAL+組IL-10表達降低更為明顯(圖1-4B),提示疾病病變程度越重,B細胞IL-10的表達水平越低;。圖1-4 B細胞及其亞群IL-10表達統(tǒng)計圖。
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本文編號：2875630