第一部分川崎病B10細(xì)胞數(shù)量及功能的研究背景:川崎病(KD)是一種兒童急性系統(tǒng)性血管炎癥,已發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞過度活化是其發(fā)病的重要環(huán)節(jié),但具體機(jī)制尚未完全闡明。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)是一類不依賴分泌免疫球蛋白且具有免疫調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞,IL-10對(duì)于其發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用必不可少,故以功能命名為“B10”細(xì)胞。研究已發(fā)現(xiàn)B10細(xì)胞在多種疾病發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色,但在川崎病中的作用卻尚未完全闡明。目的:本研究通過檢測(cè)KD患者急性和緩解期B細(xì)胞不同亞群IL-10表達(dá),分析疾病不同階段B細(xì)胞分化為B10的能力,并進(jìn)一步評(píng)估B10細(xì)胞對(duì)單核細(xì)胞功能的抑制作用,旨在探索川崎病負(fù)調(diào)控異常的原因,初步闡明單核細(xì)胞過度活化的發(fā)病機(jī)制。方法:選取深圳市兒童醫(yī)院住院KD患兒23例,根據(jù)有無冠狀動(dòng)脈損害分為有冠狀動(dòng)脈損害組(KD~(CAL+))和無冠狀動(dòng)脈損害組(KD~(CAL-))。同年齡健康兒童33例為對(duì)照組(Ctrl)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血總B細(xì)胞(CD19~+)、過渡B細(xì)胞(CD19~+CD24~hii CD38~(hi))、初始B細(xì)胞(CD19~+CD27~-CD24~(int)CD38~(int))和記憶B細(xì)胞(CD19~+CD24~(hi)CD27~+)胞內(nèi)IL-10表達(dá)水平。免疫磁珠陰性分選CD19~+B細(xì)胞及CD14~+單核細(xì)胞。Real-time PCR檢測(cè)B細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)。CpG和sCD40L體外誘導(dǎo)B細(xì)胞IL-10表達(dá),再與單核吞噬細(xì)胞共培養(yǎng),流式檢測(cè)CD14~+單核細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α表達(dá)水平。通過公式[1-(共培養(yǎng)體系中單核細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α表達(dá)/單獨(dú)培養(yǎng)單核細(xì)胞內(nèi)TNF-α表達(dá))×100)]計(jì)算抑制率。采用IBM SPSS version 20.0 Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Kolmogorov-Simonov檢驗(yàn)來評(píng)估數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:(1)KD患兒23例,男13例,女10例;年齡6-107月,平均(39.43±25.38)月。KD~(CAL+)13例(56.5%),KD~(CAL-)10例(43.5%),臨床表現(xiàn)主要包括:發(fā)熱持續(xù)時(shí)間7.48±1.93(5–13)天,皮疹(95.7%),淋巴結(jié)腫大(87.0%),結(jié)膜充血(100.0%),口唇粘膜病變(100.0%),關(guān)節(jié)炎(13.0%),手足脫皮(69.6%),膿尿(43.5%),黃疸(13.0%)及血小板增高(82.6%)。(2)四組B細(xì)胞群體均表達(dá)IL-10;過渡性和記憶性B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10水平高于初始B細(xì)胞。(3)KD急性期,各B細(xì)胞亞群IL-10表達(dá)均呈下降趨勢(shì),記憶B細(xì)胞中尤為明顯(P0.05)。IVIG治療后,各B細(xì)胞亞群IL-10表達(dá)部分恢復(fù);其中總B細(xì)胞IL-10表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)與Ctrl和KD~(CAL-)組相比,KD~(CAL+)組IL-10表達(dá)降低更為明顯。(5)與Ctrl相比,KD急性期B細(xì)胞IL-10mRNA表達(dá)水平明顯下降(P0.05);IVIG治療后,其表達(dá)水平較急性期部分恢復(fù)(P=0.061)。(6)KD組患兒外周血單核細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α表達(dá)明顯高于Ctrl(P0.05);比較自體誘導(dǎo)B10細(xì)胞對(duì)單核細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α表達(dá)的抑制率,KD組較Ctrl組降低四倍(P0.05)。(7)分別將KD組及Ctrl組誘導(dǎo)B10細(xì)胞與正常兒童單核細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng),與Ctrl組B10細(xì)胞混合培養(yǎng)的單核細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α水平較與KD組混合培養(yǎng)的單核細(xì)胞明顯降低(P0.05)。結(jié)論:(1)不同分化階段B細(xì)胞均有分泌IL-10的潛力,這種能力隨疾病狀態(tài)而改變;(2)以單一分化階段B細(xì)胞代表調(diào)節(jié)性B細(xì)胞并不恰當(dāng),而以IL-10等功能因子界定B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能更為合適。(3)KD患兒急性期B10細(xì)胞數(shù)量及功能均受損,其負(fù)調(diào)節(jié)能力下降。第二部分川崎病B10細(xì)胞micro RNA調(diào)控機(jī)制研究背景:IL-10是一種關(guān)鍵負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子,來自多種不同細(xì)胞類型,對(duì)其表達(dá)調(diào)控一直是研究重點(diǎn)。最近研究表明,IL-10和mi RNAs之間存在重要相互作用。mi RNAs調(diào)控IL-10已被證實(shí)在自身免疫和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。但以上研究大多基于單核吞噬細(xì)胞和T細(xì)胞,對(duì)于B細(xì)胞IL-10表達(dá)的mi RNAs調(diào)控卻尚乏系統(tǒng)研究。目的:本項(xiàng)目利用具有高炎癥反應(yīng)特點(diǎn)的KD疾病模型,對(duì)B10細(xì)胞mi RNAs調(diào)控機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究,深入解析該疾病B10細(xì)胞負(fù)調(diào)控異常的原因及其與單核細(xì)胞過度炎癥反應(yīng)的關(guān)系,為闡明川崎病發(fā)病機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ),以及疾病早期干預(yù)篩選新的治療靶點(diǎn)。方法:免疫磁珠陰性分選CD19+B細(xì)胞及CD14+單核細(xì)胞。流式檢測(cè)單核細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α蛋白表達(dá)水平。Real-time PCR檢測(cè)B細(xì)胞miRNAs表達(dá),包括:mi R-21-3p,mi R-98-5p/3p,mi R-27a-3p,let7b-5p和mi R-142-3p/5p表達(dá)。通過多變量分析,確定IL-10表達(dá)(因變量)與mi RNAs表達(dá)(自變量)之間的關(guān)系。通過計(jì)算Pearsons(正態(tài)數(shù)據(jù)分布)或Spearmans(非正態(tài)數(shù)據(jù)分布)相關(guān)系數(shù),初步探討IL-10與mi RNAs之間可能的聯(lián)系。采用多元線性回歸分析篩選影響IL-10表達(dá)的關(guān)鍵mi RNA。應(yīng)用多元逐步回歸分析確定最佳回歸方程(納入標(biāo)準(zhǔn)P0.05;排除標(biāo)準(zhǔn)P0.1)。利用RNA遞載材料PEI將Agomir-27-3p-FAM(Mimic)或Antagomir-27-3p-FAM(Inhibitor),及其相應(yīng)陰性對(duì)照(NC)轉(zhuǎn)染至外周血B細(xì)胞。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光標(biāo)記mi RNAs細(xì)胞內(nèi)定位,流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及胞內(nèi)IL-10表達(dá)。采用Cp G+s CD40L誘導(dǎo)培養(yǎng)B10細(xì)胞。ELISA檢測(cè)誘導(dǎo)B10細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10表達(dá)。將轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)B10細(xì)胞與CD14+單核細(xì)胞共培養(yǎng),觀察轉(zhuǎn)染后B10細(xì)胞對(duì)單核細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生的抑制作用。流式檢測(cè)單核細(xì)胞胞內(nèi)IL-10表達(dá)及Real-time PCR檢測(cè)單核細(xì)胞mi R-27a-3p表達(dá)。結(jié)果:(1)KD急性期mi R-98-5p/3p、mi R-21-5p、let7b-5p、mi R-27a-3p表達(dá)均明顯高于對(duì)照組;IVIG治療后,除let7b-5p外,其余mi RNAs表達(dá)均下調(diào)(P0.05)。KDCAL+組mi R-98-5p、mi R-27a-3p表達(dá)增加更顯著,而KDCAL-組mi R-21-5p、mi R-98-3p表達(dá)增加更顯著(P0.05)。mi R-142-3p/5p在KD急性期表達(dá)水平較對(duì)照組降低(P0.05)。mi R-106a表達(dá)水平無明顯變化。(2)選取疾病不同階段表達(dá)變化差異顯著的micro RNAs作為自變量(mi R-21-3p,mi R-98-5p/3p,mi R-27a-3p,let7b-5p,mi R-142-3p/5p),IL-10作為因變量。多因素分析結(jié)果顯示:IL-10 m RNA及蛋白表達(dá)都與mi R-27a-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.599,P0.05;r=-0.667,P0.05),但I(xiàn)L-10與其他mi RNAs之間無顯著相關(guān)關(guān)系。多元逐步回歸方程為IL-10=0.001-0.001×mi R-27a-3p(根據(jù)m RNA水平);IL-10=1.508-0.999×mi R-27a-3p(根據(jù)蛋白水平)。(3)激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染B細(xì)胞,熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。流式檢測(cè)顯示B細(xì)胞的mi RNA轉(zhuǎn)染率可達(dá)到(12.42%±0.94%)。(4)轉(zhuǎn)染KD患兒純化B細(xì)胞24h后,Antagomir-27a組B細(xì)胞IL-10表達(dá)顯著高于NC組(P0.05)。(5)轉(zhuǎn)染正常兒童B細(xì)胞24h后,流式及ELISA檢測(cè)Agomir-27a組和Antagomir-27a組B細(xì)胞胞內(nèi)及培養(yǎng)上清IL-10表達(dá)水平,均較各自NC組明顯降低或升高(P0.05)。(6)與Agomir-27a-B10細(xì)胞組共培養(yǎng)的CD14+單核細(xì)胞TNF-α表達(dá)明顯高于與Antagomir-27a-B10細(xì)胞組共培養(yǎng)的單核細(xì)胞(P0.05)。(7)正常健康兒童外周血單核細(xì)胞與KD組或Ctrl組Antagomir-27a-B10細(xì)胞共培養(yǎng),二者混合培養(yǎng)上清IL-10濃度均較各自NC組顯著升高,而單核細(xì)胞TNF-α表達(dá)均下降(P0.05)。(8)KD急性期CD14+單核細(xì)胞IL-10表達(dá)水平高于Ctrl組;KD單核細(xì)胞mi R-27a-3p m RNA表達(dá)水平在急性期也明顯高于Ctrl組,IVIG治療后表達(dá)下降。結(jié)論:KD急性期B細(xì)胞mi R-27a-3p表達(dá)上調(diào),可通過抑制B10細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)功能促進(jìn)單核細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),參與KD發(fā)病。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R725.4
【部分圖文】：

根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道[32],本研究通過使用4個(gè)膜表面標(biāo)記物(CD19、CD38、CD24和CD27)來識(shí)別不同的B細(xì)胞亞群,包括總B細(xì)胞(CD19+)、過渡B細(xì)胞(CD19+CD24hiCD38hi)、初始B細(xì)胞(CD19+CD27-CD24intCD38int)和記憶B細(xì)胞(CD19+CD24hiCD27+)(圖1-1)。細(xì)胞活性分析表明,每個(gè)B細(xì)胞亞群中存活B細(xì)胞的百分比均大于95%(圖1-2)。圖1-2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B細(xì)胞及其亞群細(xì)胞活力。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B細(xì)胞及其亞群細(xì)胞活力。

經(jīng)流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn),所有B細(xì)胞亞群均產(chǎn)生IL-10;但無論在正常情況,還是疾病狀態(tài),過渡性和記憶性B細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10水平均高于初始B細(xì)胞。在KD急性期,各B細(xì)胞亞群IL-10表達(dá)均呈下降趨勢(shì),在記憶B細(xì)胞中尤為明顯。IVIG治療后,所有B細(xì)胞亞群IL-10表達(dá)均增加,但尚未恢復(fù)至正常水平;IL-10表達(dá)水平在CD19+B細(xì)胞(總B細(xì)胞)的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1-3,圖1-4A)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn):與健康對(duì)照組和KDCAL-組相比,KDCAL+組IL-10表達(dá)降低更為明顯(圖1-4B),提示疾病病變程度越重,B細(xì)胞IL-10的表達(dá)水平越低;。圖1-4 B細(xì)胞及其亞群IL-10表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。
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本文編號(hào)：2875630