研究背景子宮頸癌在世界范圍內是女性高發(fā)惡性腫瘤,在癌癥死亡的疾病構成比中占據重要位置。在過去40年中,子宮頸癌的發(fā)病率及病死率卻發(fā)生了顯著下降,這一下降趨勢在發(fā)達國家尤其明顯。究其原因,主要是因為女性采用定期巴氏涂片篩查,從而檢出了很多癌前病變,早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療帶來的結果。高危HPV(如HPV-16和HPV-18亞型)的慢性、持續(xù)性感染是子宮頸癌變發(fā)生的主要原因。盡管高危HPV分泌的的癌基因E6、E7在宮頸細胞惡性轉化過程中起到了關鍵作用,然而更多的研究表明,僅有HPV感染不足以導致細胞惡變。在癌癥的發(fā)生發(fā)展機制中,多種癌基因或者抑癌基因的異常表達幾乎同樣重要。子宮頸的癌前病變在組織病理學上被定義為上皮內瘤變(CIN, cervical intra-epithelial neoplasia),依次分級為CINⅠ、CIN Ⅱ、CINⅢ。后兩者通常又歸類為高級別上皮內瘤變。臨床上如果不給于恰當治療則傾向于發(fā)展為癌。然而,正常子宮頸鱗狀上皮細胞是如何演變?yōu)樯掀攘鲎儾⒗^而發(fā)展為浸潤性癌的?確切的分子生物學機制尚未完全闡明。已經有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤生長過程中存在轉錄因子和凋亡相關基因表達的突變、抑制或缺失等機制。近期的研究結果報道,病毒和其他細胞因子能夠結合GRIM-19,進而阻止了細胞死亡程序的啟動。GRIM-19與細胞的凋亡、生長抑制、遷移、侵襲性及上皮-間質轉化(EMT)等密切相關。在前列腺癌、原發(fā)性腎癌、口腔鱗癌、頭頸腫瘤,肝癌和結直腸癌等常見惡性腫瘤中已經發(fā)現(xiàn)存在GRIM-19表達的缺失。在大多數(shù)癌癥中,GRIM-19的mRNA幾乎不存在突變。我們已經在前期研究工作中報道了GRIM-19通過以下三條途徑抑制宮頸癌的生長：①下調STAT3誘導的基因表達;②拮抗E6/E6AP復合物形成誘導p53聚集；③誘導宮頸癌細胞的E6AP的自動泛素化。本研究中,我們旨在探討宮頸組織和脫落細胞中GRIM-19的表達情況,試圖闡明GRIM-19在腫瘤發(fā)生過程中是否存在下降?同時分析宮頸癌細胞在接受電離輻射后,GRIM-19和其調節(jié)蛋白p53的變化。本研究分為兩部分：第一部分：沉默GRIM-19表達在體內、外實驗中是否促進子宮頸癌的生長；電離輻射如何改變了癌細胞中GRIM-19和P53的表達。第二部分：GRIM-19表達減少與子宮頸病變脫落細胞、上皮內瘤變及癌變的相關性,及其與高危HPV感染的相關性。第一部分：GRIM-19在子宮頸癌細胞中的表達及其與電離輻射的關系目的：1.探討GRIM-19在子宮頸癌組織中的表達水平；2.體內、外實驗探討沉默GRIM-19的表達對腫瘤細胞生長的影響及機制；3.探討子宮頸癌細胞電離輻射后的GRIM-19表達水平變化。方法：采用Hela、SiHa(人子宮頸癌細胞株)、HaCaT(人類正常角化細胞株)以及臨床組織標本分析GRIM-19的表達情況。臨床標本來自安徽省立醫(yī)院2010年2月～2013年7月期間30例子宮頸癌患者活檢組織標本,所有患者均無遠處轉移；根據FIGO2014分期,ⅠB期標本10例,ⅡA期5例,ⅡB期5例,Ⅲ期10例,其中鱗狀細胞癌20例,腺癌10例。另外20例子宮體肌瘤或宮頸管肌瘤患者在接受子宮肌瘤手術中,獲得了正常子宮頸組織標本用于對照試驗。另外選取HeLa, SiHa細胞株在電離輻射300cGy前后,進展期子宮頸癌在放射治療(常規(guī)外照射40Gy)前后共20份子宮頸脫落細胞涂片用于研究。所有的Pap檢驗搜集于PreservCyte溶液,hinPrep法(Hologic, Marlborough, MA)。所有臨床病例均經過活檢病理明確診斷,液基細胞學涂片由至少兩位有資質的細胞病理學家閱片并診斷。HeLa細胞(用GRIM-19 siRNA或對照組siRNA穩(wěn)定轉染)移植到6周齡的去胸腺雌性裸鼠背部皮膚下(每組有8只)用來觀察腫瘤生長情況。以上標本進行如下研究：①免疫組化方法和western blot分析GRIM-19在子宮頸癌細胞株及臨床組織中的表達水平；②細胞增殖實驗及裸鼠成瘤實驗探討沉默GRIM-19后,腫瘤細胞的生長情況及機制；③宮頸癌細胞株電離輻射前后、以及人體子宮頸癌細胞放射治療前后的脫落細胞中GRIM-19表達水平變化。結果：1. GRIM-19在正常子宮頸組織中的表達：近年研究中認為GRIM-19是一類的腫瘤抑制因子,我們首先在子宮頸癌細胞中檢測了GRIM-19的表達情況。30份石蠟包埋的子宮頸癌標本和20份正常宮頸組織標本采用GRIM-19特異性的單抗隆抗體標記,進行免疫組織化學分析顯示：GRIM-19在正常宮頸鱗狀上皮和腺上皮中高表達,但是在鱗狀細胞癌和腺癌中表達顯著減少(如圖1 A)。免疫組化定量結果示GRIM-19蛋白表達水平在宮頸鱗癌及腺癌組織中明顯降低(P0.05)(圖1B)。Western blotting結果顯示宮頸癌組織中GRIM-19表達蛋白水平顯著下調(如圖1 C)。2. GRIM-19表達減少促進Hela細胞株增殖：為了檢測GRIM-19與細胞生長的生物學相關性,我們首先檢測了GRIM-19在子宮頸細胞株中的表達水平。與人類正常角化細胞系HaCaT相比較,宮頸癌細胞系Hela和SiHa中GRM-19表達明顯降低。采用siRNA抑制GRIM-19表達之后,與對照組相比較,在MTT實驗中HeLa/G19 siRNA組細胞的增殖速度在第4天和第5天明顯加快(p0.05)(圖2)。3. GRIM-19沉默后體內成瘤情況體內實驗顯示GRIM-19表達減少促進了腫瘤生長：為了評估GRIM-19在動物實驗腫瘤生長中的作用,分別使用1×107HeLa/pCon和HeLa/G19 siRNA細胞種植到到裸鼠背部皮下組織(每組8只),監(jiān)測腫瘤生長情況,并于42天處死(圖3)。結果顯示：第42天HeLa/G19 siRNA組腫瘤體積均值為9.8175±0.7198mm3;而對照組為7.12678±0.5689 mm3,兩組差異顯著(p0.05)。剝除腫瘤通過RT-PCR和western blotting實驗方法進一步驗證了GRIM-19的抑制情況,同時我們發(fā)現(xiàn),HeLa/G19 siRNA組中p53的表達降低,而STAT3表達水平顯著升高。為了進一步探討GRIM-19與腫瘤生長之間的關系,我們采用免疫組織化學方法檢測增殖相關抗原Ki-67的表達情況。實驗結果顯示：與對照組相比較,在沉默GRIM-19基因的實驗組腫瘤組織中Ki-67的表達顯著升高(圖3 E-F)。4.宮頸癌細胞電離輻射后GRIM-19表達顯著升高我們還檢測了HeLa和SiHa細胞株在電離輻射后GRIM-19的表達情況。將HeLa與SiHa細胞株在1.5分鐘內接受300cGy高能X射線(6MV-X),24小時后檢測p53和GRIM-19水平發(fā)現(xiàn)表達上調。人進展期子宮頸外照射40Gy(常規(guī)分割)前后選取脫落細胞,取材前使用0.05%高錳酸鉀溶液充分沖洗陰道,然后檢測p53和GRIM-19的表達情況。結果顯示：進展期鱗狀細胞癌放射治療后子宮頸表面脫落細胞的p53和GRIM-19表達明顯升高(如圖4)。結論：GRIM-19基因在正常宮頸上皮細胞中高表達,在宮頸癌細胞中低表達；GRIM-19在宮頸癌細胞中表達降低通過下調p53蛋白和STAT3表達升高而促進腫瘤細胞生長和增殖；電離輻射殺傷癌細胞機制之一可能是通過上調GRIM-19表達致p53蛋白積聚而起到抗腫瘤的作用。第二部分：GRIM-19在子宮頸癌前病變及癌細胞中的表達水平及其與高危HPV感染的相關性目的：1.研究GRIM-19在人子宮頸脫落細胞中的表達特點及水平；2.研究GRIM-19的表達與高危型HPV感染的相關性；3.研究GRIM-19在癌前病變組織中的表達水平。方法：選取安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院婦科細胞學實驗室的液基細胞學標本,包括正常鱗狀上皮細胞涂片40張,ASCUS(不典型鱗狀上皮細胞)涂片40張,LSIL(低度鱗狀上皮內瘤變)涂片40張,HSIL(高度鱗狀上皮內瘤變)涂片40張以及確診SCC(子宮頸鱗癌)患者的脫落癌細胞標本20張。排除標準為：年齡21歲,既往接受過子宮切除手術,無足夠殘留液體提取細胞蛋白質。所有的Pap檢驗均使用PreservCyte溶液采集、并用[hinPrep法(Hologic,Marlborough,MA,USA)處理。陰道鏡下直取活檢標本包括：20例正常宮頸組織、35例CIN Ⅰ、30例CIN Ⅱ、30例CIN Ⅲ和20例鱗狀細胞癌標本,經10%福爾馬林緩沖液固定后蘇木精伊紅常規(guī)方法染色。所有的巴氏涂片與組織學活檢切片經由至少一位有經驗的婦科腫瘤病理學家兼細胞病理學家復閱。子宮頸脫落細胞的液基細胞學診斷報告采用Bethesda系統(tǒng),活檢標本的組織病理學報告使用CIN(上皮內瘤變)方法。進行以下研究：①通過免疫組化分析子宮頸脫落細胞中GRIM-19表達的特點及水平；②通過Western Blotting分析子宮頸脫落細胞及宮頸癌細胞株中GRM-19表達的水平；③通過HC-2方法檢測HPV感染情況,并分析子宮頸癌前病變中GRIM-19與高危HPV感染的關系；④通過.免疫組化進一步驗證GRIM-19在不同級別的子宮頸上皮內瘤變和鱗狀細胞癌中表達的水平及相關性。統(tǒng)計學分析采用SPSS軟件。結果：1.子宮頸脫落細胞中GRIM-19表達的免疫組化分析子宮頸鱗狀上皮結構總體上分為三層：表皮層(角化細胞),中間層,基底層。臨床上細胞涂片檢驗采集到的子宮頸脫落細胞主要來自表皮層和中間層。我們首先分析了GRIM-19在脫落細胞中的表達,GRIM-19在子宮頸鱗狀上皮的中層細胞中表達率為94.2±2.8%(188.4±5.5/200)(如圖1a和a’)；而在表層細胞中的表達率是0±0%(0±0.00/200)(如圖1 b和b’)。因此GRIM-19主要表達在中層細胞中,而在表層細胞(角化細胞)中不表達。我們在相應的巴氏涂片中分別記數(shù)了ASCUS細胞、LSIL細胞、HSIL細胞和SCC細胞各200個,以檢測GRIM-19的表達情況。GRIM-19在ASCUS、LSIL、HSIL、SCC細胞中表達依次減低(如圖2),其陰性表達率分別為：ASCUS 16.5%, LSIL 32.0%, HSIL 60.5%, SCC 97.5%(表1)。這一結果提示在子宮頸癌惡性轉化的過程中GRIM-19的表達逐漸下調。GRIM-19的表達與細胞學診斷結果高度相關(p0.001)。2.子宮頸脫落細胞GRIM-19表達的Western Blotting分析我們采用western blotting進一步研究了GRIM-19的表達水平。因為在子宮頸表皮層脫落細胞中GRIM-19不表達,所以我們在每一張涂片上計算出細胞表達百分比。在得出GRIM-19/GAPDH表達的蛋白含量數(shù)值之后,子宮頸中層細胞的GRM-19表達的相對含量采用公式：中層脫落細胞／(中層脫落細胞+表層脫落細胞)×100%。在正常宮頸中層脫落細胞中的GRIM-19/GAPDH實驗組的比值被標準化定義為l。實驗發(fā)現(xiàn),與正常子宮頸鱗狀上皮的中層細胞相比較,GRM-19表達在LSIL (P0.05)、HSIL(P0.05)、SCCs (P0.001)細胞中表達顯著降低(如圖3A-C)。3.子宮頸癌前病變中GRIM-19表達與高危HPV感染的關系由于子宮頸鱗狀細胞癌與高危HPV持續(xù)感染密切相關,我們進一步探討了子宮頸脫落細胞中高危HPV感染和GRIM-19表達之間的關系。結果顯示GRM-19的表達與高危HPV感染負相關(X2=57.583,r=-0.268,P0.001)(見表2)。4.GRIM-19在不同級別的子宮頸上皮內瘤變和鱗狀細胞癌中表達的免疫組化分析為了進一步驗證GRIM-19在宮頸脫落細胞中的結果,我們通過陰道鏡直取活檢組織標本,在不同級別的上皮內瘤變與浸潤性鱗癌組織中再次分析了GRIM-19的表達情況(如圖4A-E)。結果發(fā)現(xiàn),GRIM-19在正常子宮頸上皮的中層、基底層細胞的胞漿中表達幾乎為100%(20/20)。免疫組織化學分析的研究結果顯示GRIM-19陰性表達率為：CIN Ⅰ 20.0%(7/35), CIN Ⅱ23.3%(7/30), CINⅢ56.7% (17/30), SCC 95.0%(19/20).免疫組化染色評分結果顯示,與正常宮頸組織相比,GRIM-19的表達水平在CINⅠ、CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中依次下降,且CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中的表達顯著下降統(tǒng)計學上有差異,分別為P0.05、P0.05、P0.001(如圖4F)。GRIM-19的表達與病理組織學診斷結果高度相關(p0.001)(表3)。結論：1. GRIM-19主要表達在正常宮頸上皮的中層細胞,而在表層細胞(角化細胞)中不表達。2. GRIM-19的表達與細胞學診斷結果高度相關：其表達水平在LSIL、HSIL、SCC細胞中依次降低。3. GRIM-19的表達與病理組織學診斷結果高度相關：其表達水平在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中依次逐漸下降,且CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中的表達顯著下降。4. GRIM-19的表達與高危HPV感染負相關,GRIM-19表達的下調可能是HR-HPV感染致上皮細胞的惡性轉化的關鍵因素之一。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R737.33
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮略表（abbreviations）
第一部分：GR1M-19在子宮頸癌細胞中的表達水平及其與電離輻射的關系
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    附圖表
    參考文獻
第二部分：GRIM-19表達減少與高危HPV感染后宮頸上皮內瘤變及子宮頸癌之間的相關性
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    附圖表
    參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表論文及科研成果
外文論文1
外文論文2
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本文編號：2875380