研究背景子宮頸癌在世界范圍內(nèi)是女性高發(fā)惡性腫瘤,在癌癥死亡的疾病構(gòu)成比中占據(jù)重要位置。在過去40年中,子宮頸癌的發(fā)病率及病死率卻發(fā)生了顯著下降,這一下降趨勢在發(fā)達(dá)國家尤其明顯。究其原因,主要是因?yàn)榕圆捎枚ㄆ诎褪贤科Y查,從而檢出了很多癌前病變,早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療帶來的結(jié)果。高危HPV(如HPV-16和HPV-18亞型)的慢性、持續(xù)性感染是子宮頸癌變發(fā)生的主要原因。盡管高危HPV分泌的的癌基因E6、E7在宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中起到了關(guān)鍵作用,然而更多的研究表明,僅有HPV感染不足以導(dǎo)致細(xì)胞惡變。在癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中,多種癌基因或者抑癌基因的異常表達(dá)幾乎同樣重要。子宮頸的癌前病變在組織病理學(xué)上被定義為上皮內(nèi)瘤變(CIN, cervical intra-epithelial neoplasia),依次分級(jí)為CINⅠ、CIN Ⅱ、CINⅢ。后兩者通常又歸類為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。臨床上如果不給于恰當(dāng)治療則傾向于發(fā)展為癌。然而,正常子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞是如何演變?yōu)樯掀?nèi)瘤變并繼而發(fā)展為浸潤性癌的?確切的分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤生長過程中存在轉(zhuǎn)錄因子和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的突變、抑制或缺失等機(jī)制。近期的研究結(jié)果報(bào)道,病毒和其他細(xì)胞因子能夠結(jié)合GRIM-19,進(jìn)而阻止了細(xì)胞死亡程序的啟動(dòng)。GRIM-19與細(xì)胞的凋亡、生長抑制、遷移、侵襲性及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等密切相關(guān)。在前列腺癌、原發(fā)性腎癌、口腔鱗癌、頭頸腫瘤,肝癌和結(jié)直腸癌等常見惡性腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在GRIM-19表達(dá)的缺失。在大多數(shù)癌癥中,GRIM-19的mRNA幾乎不存在突變。我們已經(jīng)在前期研究工作中報(bào)道了GRIM-19通過以下三條途徑抑制宮頸癌的生長：①下調(diào)STAT3誘導(dǎo)的基因表達(dá);②拮抗E6/E6AP復(fù)合物形成誘導(dǎo)p53聚集；③誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的E6AP的自動(dòng)泛素化。本研究中,我們旨在探討宮頸組織和脫落細(xì)胞中GRIM-19的表達(dá)情況,試圖闡明GRIM-19在腫瘤發(fā)生過程中是否存在下降?同時(shí)分析宮頸癌細(xì)胞在接受電離輻射后,GRIM-19和其調(diào)節(jié)蛋白p53的變化。本研究分為兩部分：第一部分：沉默GRIM-19表達(dá)在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中是否促進(jìn)子宮頸癌的生長；電離輻射如何改變了癌細(xì)胞中GRIM-19和P53的表達(dá)。第二部分：GRIM-19表達(dá)減少與子宮頸病變脫落細(xì)胞、上皮內(nèi)瘤變及癌變的相關(guān)性,及其與高危HPV感染的相關(guān)性。第一部分：GRIM-19在子宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與電離輻射的關(guān)系目的：1.探討GRIM-19在子宮頸癌組織中的表達(dá)水平；2.體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)探討沉默GRIM-19的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響及機(jī)制；3.探討子宮頸癌細(xì)胞電離輻射后的GRIM-19表達(dá)水平變化。方法：采用Hela、SiHa(人子宮頸癌細(xì)胞株)、HaCaT(人類正常角化細(xì)胞株)以及臨床組織標(biāo)本分析GRIM-19的表達(dá)情況。臨床標(biāo)本來自安徽省立醫(yī)院2010年2月～2013年7月期間30例子宮頸癌患者活檢組織標(biāo)本,所有患者均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；根據(jù)FIGO2014分期,ⅠB期標(biāo)本10例,ⅡA期5例,ⅡB期5例,Ⅲ期10例,其中鱗狀細(xì)胞癌20例,腺癌10例。另外20例子宮體肌瘤或?qū)m頸管肌瘤患者在接受子宮肌瘤手術(shù)中,獲得了正常子宮頸組織標(biāo)本用于對(duì)照試驗(yàn)。另外選取HeLa, SiHa細(xì)胞株在電離輻射300cGy前后,進(jìn)展期子宮頸癌在放射治療(常規(guī)外照射40Gy)前后共20份子宮頸脫落細(xì)胞涂片用于研究。所有的Pap檢驗(yàn)搜集于PreservCyte溶液,hinPrep法(Hologic, Marlborough, MA)。所有臨床病例均經(jīng)過活檢病理明確診斷,液基細(xì)胞學(xué)涂片由至少兩位有資質(zhì)的細(xì)胞病理學(xué)家閱片并診斷。HeLa細(xì)胞(用GRIM-19 siRNA或?qū)φ战MsiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)移植到6周齡的去胸腺雌性裸鼠背部皮膚下(每組有8只)用來觀察腫瘤生長情況。以上標(biāo)本進(jìn)行如下研究：①免疫組化方法和western blot分析GRIM-19在子宮頸癌細(xì)胞株及臨床組織中的表達(dá)水平；②細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)探討沉默GRIM-19后,腫瘤細(xì)胞的生長情況及機(jī)制；③宮頸癌細(xì)胞株電離輻射前后、以及人體子宮頸癌細(xì)胞放射治療前后的脫落細(xì)胞中GRIM-19表達(dá)水平變化。結(jié)果：1. GRIM-19在正常子宮頸組織中的表達(dá)：近年研究中認(rèn)為GRIM-19是一類的腫瘤抑制因子,我們首先在子宮頸癌細(xì)胞中檢測了GRIM-19的表達(dá)情況。30份石蠟包埋的子宮頸癌標(biāo)本和20份正常宮頸組織標(biāo)本采用GRIM-19特異性的單抗隆抗體標(biāo)記,進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析顯示：GRIM-19在正常宮頸鱗狀上皮和腺上皮中高表達(dá),但是在鱗狀細(xì)胞癌和腺癌中表達(dá)顯著減少(如圖1 A)。免疫組化定量結(jié)果示GRIM-19蛋白表達(dá)水平在宮頸鱗癌及腺癌組織中明顯降低(P0.05)(圖1B)。Western blotting結(jié)果顯示宮頸癌組織中GRIM-19表達(dá)蛋白水平顯著下調(diào)(如圖1 C)。2. GRIM-19表達(dá)減少促進(jìn)Hela細(xì)胞株增殖：為了檢測GRIM-19與細(xì)胞生長的生物學(xué)相關(guān)性,我們首先檢測了GRIM-19在子宮頸細(xì)胞株中的表達(dá)水平。與人類正常角化細(xì)胞系HaCaT相比較,宮頸癌細(xì)胞系Hela和SiHa中GRM-19表達(dá)明顯降低。采用siRNA抑制GRIM-19表達(dá)之后,與對(duì)照組相比較,在MTT實(shí)驗(yàn)中HeLa/G19 siRNA組細(xì)胞的增殖速度在第4天和第5天明顯加快(p0.05)(圖2)。3. GRIM-19沉默后體內(nèi)成瘤情況體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示GRIM-19表達(dá)減少促進(jìn)了腫瘤生長：為了評(píng)估GRIM-19在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤生長中的作用,分別使用1×107HeLa/pCon和HeLa/G19 siRNA細(xì)胞種植到到裸鼠背部皮下組織(每組8只),監(jiān)測腫瘤生長情況,并于42天處死(圖3)。結(jié)果顯示：第42天HeLa/G19 siRNA組腫瘤體積均值為9.8175±0.7198mm3;而對(duì)照組為7.12678±0.5689 mm3,兩組差異顯著(p0.05)。剝除腫瘤通過RT-PCR和western blotting實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步驗(yàn)證了GRIM-19的抑制情況,同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),HeLa/G19 siRNA組中p53的表達(dá)降低,而STAT3表達(dá)水平顯著升高。為了進(jìn)一步探討GRIM-19與腫瘤生長之間的關(guān)系,我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測增殖相關(guān)抗原Ki-67的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比較,在沉默GRIM-19基因的實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)顯著升高(圖3 E-F)。4.宮頸癌細(xì)胞電離輻射后GRIM-19表達(dá)顯著升高我們還檢測了HeLa和SiHa細(xì)胞株在電離輻射后GRIM-19的表達(dá)情況。將HeLa與SiHa細(xì)胞株在1.5分鐘內(nèi)接受300cGy高能X射線(6MV-X),24小時(shí)后檢測p53和GRIM-19水平發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。人進(jìn)展期子宮頸外照射40Gy(常規(guī)分割)前后選取脫落細(xì)胞,取材前使用0.05%高錳酸鉀溶液充分沖洗陰道,然后檢測p53和GRIM-19的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：進(jìn)展期鱗狀細(xì)胞癌放射治療后子宮頸表面脫落細(xì)胞的p53和GRIM-19表達(dá)明顯升高(如圖4)。結(jié)論：GRIM-19基因在正常宮頸上皮細(xì)胞中高表達(dá),在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)；GRIM-19在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)降低通過下調(diào)p53蛋白和STAT3表達(dá)升高而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和增殖；電離輻射殺傷癌細(xì)胞機(jī)制之一可能是通過上調(diào)GRIM-19表達(dá)致p53蛋白積聚而起到抗腫瘤的作用。第二部分：GRIM-19在子宮頸癌前病變及癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及其與高危HPV感染的相關(guān)性目的：1.研究GRIM-19在人子宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)及水平；2.研究GRIM-19的表達(dá)與高危型HPV感染的相關(guān)性；3.研究GRIM-19在癌前病變組織中的表達(dá)水平。方法：選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦科細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室的液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本,包括正常鱗狀上皮細(xì)胞涂片40張,ASCUS(不典型鱗狀上皮細(xì)胞)涂片40張,LSIL(低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變)涂片40張,HSIL(高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變)涂片40張以及確診SCC(子宮頸鱗癌)患者的脫落癌細(xì)胞標(biāo)本20張。排除標(biāo)準(zhǔn)為：年齡21歲,既往接受過子宮切除手術(shù),無足夠殘留液體提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。所有的Pap檢驗(yàn)均使用PreservCyte溶液采集、并用[hinPrep法(Hologic,Marlborough,MA,USA)處理。陰道鏡下直取活檢標(biāo)本包括：20例正常宮頸組織、35例CIN Ⅰ、30例CIN Ⅱ、30例CIN Ⅲ和20例鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本,經(jīng)10%福爾馬林緩沖液固定后蘇木精伊紅常規(guī)方法染色。所有的巴氏涂片與組織學(xué)活檢切片經(jīng)由至少一位有經(jīng)驗(yàn)的婦科腫瘤病理學(xué)家兼細(xì)胞病理學(xué)家復(fù)閱。子宮頸脫落細(xì)胞的液基細(xì)胞學(xué)診斷報(bào)告采用Bethesda系統(tǒng),活檢標(biāo)本的組織病理學(xué)報(bào)告使用CIN(上皮內(nèi)瘤變)方法。進(jìn)行以下研究：①通過免疫組化分析子宮頸脫落細(xì)胞中GRIM-19表達(dá)的特點(diǎn)及水平；②通過Western Blotting分析子宮頸脫落細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞株中GRM-19表達(dá)的水平；③通過HC-2方法檢測HPV感染情況,并分析子宮頸癌前病變中GRIM-19與高危HPV感染的關(guān)系；④通過.免疫組化進(jìn)一步驗(yàn)證GRIM-19在不同級(jí)別的子宮頸上皮內(nèi)瘤變和鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的水平及相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS軟件。結(jié)果：1.子宮頸脫落細(xì)胞中GRIM-19表達(dá)的免疫組化分析子宮頸鱗狀上皮結(jié)構(gòu)總體上分為三層：表皮層(角化細(xì)胞),中間層,基底層。臨床上細(xì)胞涂片檢驗(yàn)采集到的子宮頸脫落細(xì)胞主要來自表皮層和中間層。我們首先分析了GRIM-19在脫落細(xì)胞中的表達(dá),GRIM-19在子宮頸鱗狀上皮的中層細(xì)胞中表達(dá)率為94.2±2.8%(188.4±5.5/200)(如圖1a和a’)；而在表層細(xì)胞中的表達(dá)率是0±0%(0±0.00/200)(如圖1 b和b’)。因此GRIM-19主要表達(dá)在中層細(xì)胞中,而在表層細(xì)胞(角化細(xì)胞)中不表達(dá)。我們在相應(yīng)的巴氏涂片中分別記數(shù)了ASCUS細(xì)胞、LSIL細(xì)胞、HSIL細(xì)胞和SCC細(xì)胞各200個(gè),以檢測GRIM-19的表達(dá)情況。GRIM-19在ASCUS、LSIL、HSIL、SCC細(xì)胞中表達(dá)依次減低(如圖2),其陰性表達(dá)率分別為：ASCUS 16.5%, LSIL 32.0%, HSIL 60.5%, SCC 97.5%(表1)。這一結(jié)果提示在子宮頸癌惡性轉(zhuǎn)化的過程中GRIM-19的表達(dá)逐漸下調(diào)。GRIM-19的表達(dá)與細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果高度相關(guān)(p0.001)。2.子宮頸脫落細(xì)胞GRIM-19表達(dá)的Western Blotting分析我們采用western blotting進(jìn)一步研究了GRIM-19的表達(dá)水平。因?yàn)樵谧訉m頸表皮層脫落細(xì)胞中GRIM-19不表達(dá),所以我們在每一張涂片上計(jì)算出細(xì)胞表達(dá)百分比。在得出GRIM-19/GAPDH表達(dá)的蛋白含量數(shù)值之后,子宮頸中層細(xì)胞的GRM-19表達(dá)的相對(duì)含量采用公式：中層脫落細(xì)胞／(中層脫落細(xì)胞+表層脫落細(xì)胞)×100%。在正常宮頸中層脫落細(xì)胞中的GRIM-19/GAPDH實(shí)驗(yàn)組的比值被標(biāo)準(zhǔn)化定義為l。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與正常子宮頸鱗狀上皮的中層細(xì)胞相比較,GRM-19表達(dá)在LSIL (P0.05)、HSIL(P0.05)、SCCs (P0.001)細(xì)胞中表達(dá)顯著降低(如圖3A-C)。3.子宮頸癌前病變中GRIM-19表達(dá)與高危HPV感染的關(guān)系由于子宮頸鱗狀細(xì)胞癌與高危HPV持續(xù)感染密切相關(guān),我們進(jìn)一步探討了子宮頸脫落細(xì)胞中高危HPV感染和GRIM-19表達(dá)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示GRM-19的表達(dá)與高危HPV感染負(fù)相關(guān)(X2=57.583,r=-0.268,P0.001)(見表2)。4.GRIM-19在不同級(jí)別的子宮頸上皮內(nèi)瘤變和鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的免疫組化分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證GRIM-19在宮頸脫落細(xì)胞中的結(jié)果,我們通過陰道鏡直取活檢組織標(biāo)本,在不同級(jí)別的上皮內(nèi)瘤變與浸潤性鱗癌組織中再次分析了GRIM-19的表達(dá)情況(如圖4A-E)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),GRIM-19在正常子宮頸上皮的中層、基底層細(xì)胞的胞漿中表達(dá)幾乎為100%(20/20)。免疫組織化學(xué)分析的研究結(jié)果顯示GRIM-19陰性表達(dá)率為：CIN Ⅰ 20.0%(7/35), CIN Ⅱ23.3%(7/30), CINⅢ56.7% (17/30), SCC 95.0%(19/20).免疫組化染色評(píng)分結(jié)果顯示,與正常宮頸組織相比,GRIM-19的表達(dá)水平在CINⅠ、CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中依次下降,且CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中的表達(dá)顯著下降統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異,分別為P0.05、P0.05、P0.001(如圖4F)。GRIM-19的表達(dá)與病理組織學(xué)診斷結(jié)果高度相關(guān)(p0.001)(表3)。結(jié)論：1. GRIM-19主要表達(dá)在正常宮頸上皮的中層細(xì)胞,而在表層細(xì)胞(角化細(xì)胞)中不表達(dá)。2. GRIM-19的表達(dá)與細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果高度相關(guān)：其表達(dá)水平在LSIL、HSIL、SCC細(xì)胞中依次降低。3. GRIM-19的表達(dá)與病理組織學(xué)診斷結(jié)果高度相關(guān)：其表達(dá)水平在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中依次逐漸下降,且CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中的表達(dá)顯著下降。4. GRIM-19的表達(dá)與高危HPV感染負(fù)相關(guān),GRIM-19表達(dá)的下調(diào)可能是HR-HPV感染致上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R737.33
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮略表（abbreviations）
第一部分：GR1M-19在子宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及其與電離輻射的關(guān)系
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖表
    參考文獻(xiàn)
第二部分：GRIM-19表達(dá)減少與高危HPV感染后宮頸上皮內(nèi)瘤變及子宮頸癌之間的相關(guān)性
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖表
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文及科研成果
外文論文1
外文論文2
附件

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