研究背景和目的:癲癇是一類以腦內(nèi)神經(jīng)元異常同步放電為特點的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,目前全球約有7000萬人罹患此病,因此癲癇成為發(fā)病率最高與最嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一,給個人、家庭及社會帶來了沉重的負擔。癲癇的發(fā)病機制復雜,通常認為在其發(fā)病過程中存在神經(jīng)元的過度興奮,即存在谷氨酸能信號轉導的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和γ-氨基丁酸能信號轉導的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的失衡。目前癲癇治療策略的選擇主要以其發(fā)病機制為基礎,但仍有至少1/3患者的病情不能得到良好的控制。因此,對于癲癇發(fā)病機制的深入研究顯得尤為重要。近年來,大量研究證實在癲癇發(fā)病過程中伴有免疫紊亂或異常,目前也有越來越多的研究側重于癲癇的神經(jīng)免疫與神經(jīng)炎癥機制,而小膠質(zhì)細胞作為其中重要的免疫學因素也逐漸成為研究的焦點與熱點。小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)最重要的免疫細胞之一,在維持正常神經(jīng)功能和參與疾病的病理生理過程中都起到不可忽視的作用。生理條件下,小膠質(zhì)細胞的功能包括免疫監(jiān)視,參與神經(jīng)細胞及少突膠質(zhì)細胞發(fā)生,促進神經(jīng)細胞生存,清除凋亡神經(jīng)元以及調(diào)節(jié)突觸可塑性等。然而在過度激活的狀態(tài)下,小膠質(zhì)細胞則可能產(chǎn)生并釋放過量的一氧化氮等神經(jīng)毒性物質(zhì),引起劇烈的氧化應激反應并誘導神經(jīng)細胞死亡或損傷。在癲癇腦組織中,小膠質(zhì)細胞既可以表現(xiàn)為促癲癇性也可以表現(xiàn)為抗癲癇性,可能與其多態(tài)性有關。在此基礎上,代謝型谷氨酸受體(metabotropic gluatamate receptor,m Glu R)興奮后可能誘導小膠質(zhì)細胞轉換為更加復雜的表型,因此研究者們更需要關注小膠質(zhì)細胞在癲癇發(fā)病的不同時期中的角色變化。迄今,針對代謝性谷氨酸受體興奮的靜息型、促炎型(M1)與抑炎型(M2)小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元興奮性影響的研究較少,因此,本研究擬建立不同激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞模型,以此為基礎研究小膠質(zhì)細胞自身功能的變化與其機制以及對神經(jīng)細胞的影響,并側重于尋找小膠質(zhì)細胞與癲癇產(chǎn)生相關的細胞生存通路和病理性通路并驗證其作用,探討調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞激活和炎癥反應作為癲癇治療策略的可能性。研究方法:(1)取N13小膠質(zhì)細胞系進行傳代培養(yǎng),應用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、白細胞介素-4(interleukin,IL-4)/白細胞介素-10(interleukin,IL-10)/轉化生長因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)以及DHPG、LY 354740、L-AP4等m Glu R激動劑分別建立靜息狀態(tài)、促炎狀態(tài)以及抑炎狀態(tài)下的小膠質(zhì)細胞代謝型谷氨酸受體激活模型,應用熒光測定法、ELISA等方法檢測一氧化氮(nitric oxide,NO)釋放量、白細胞介素-1β(interleukin,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin,IL-6)、IL-4、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)等細胞因子釋放量。(2)取N13小膠質(zhì)細胞系進行傳代培養(yǎng),應用LPS以及DHPG、L-AP4等m Glu R激動劑建立靜息狀態(tài)以及促炎狀態(tài)下的小膠質(zhì)細胞代謝型谷氨酸受體激活模型,應用Western Blot、q PCR等方法檢測小膠質(zhì)細胞炎癥通路及谷氨酸通路關鍵通路蛋白及長鏈非編碼RNA的表達水平。(3)取C1300神經(jīng)元細胞系進行傳代培養(yǎng),應用上述不同狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞上清液刺激神經(jīng)元,建立靜息狀態(tài)、促炎狀態(tài)以及抑炎狀態(tài)下的小膠質(zhì)細胞m Glu R激活后刺激神經(jīng)細胞的模型,通過檢測CCK8、LDH水平、谷氨酸釋放量等評估神經(jīng)元活性及損傷程度,Western Blot檢測N-甲基-D-天冬氨酸(n-methyl-d-aspartate,NMDA)受體、鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II,Cam K II)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,i NOS)等興奮性相關通路蛋白表達或激活水平。(4)本研究的數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學軟件SPSS 22(SPSS,USA)分析,數(shù)據(jù)以平均值±標準差(SD)表示。應用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey′s post hoc檢驗進行組間比較。對于本研究中的所有數(shù)據(jù),設定P0.05表示數(shù)據(jù)之間有顯著性差異,具有統(tǒng)計學意義。研究結果:(1)對于M1型小膠質(zhì)細胞,激活m Glu R I可以使IL-1β、IL-6釋放減少以及使IL-4、TNF-α釋放增加。m Glu R II的激活可以使IL-1β釋放增多。m Glu R III的激活可以使IL-6釋放減少,以上數(shù)據(jù)與對照組相比均有統(tǒng)計學差異。(2)對于M2型小膠質(zhì)細胞,m Glu R I的激活可以使IL-6與IL-4釋放增加以及TNF-α釋放減少。m Glu R II的激活可以使IL-4釋放增多以及TNF-α釋放減少。m Glu R III的激活可以使IL-1β釋放減少、IL-6以及IL-4釋放增加,以上數(shù)據(jù)與對照組相比均有統(tǒng)計學差異。(3)DHPG和L-AP4都可以抑制M1型小膠質(zhì)細胞p-NF-κb p65的表達,從而起到對激活的NF-κb信號通路的抑制作用。DHPG和L-AP4刺激的靜息狀態(tài)和M1型小膠質(zhì)細胞可以上調(diào)p-PKA的表達。DHPG和L-AP4可以降低M1型小膠質(zhì)細胞p44/42 MAPK水平,以上數(shù)據(jù)與對照組相比均有統(tǒng)計學差異。(4)M1型小膠質(zhì)細胞受DHPG刺激后,PI3K-Kinase p85α與GSK-3β的表達水平均上調(diào),與對照組相比有統(tǒng)計學差異。但M1型小膠質(zhì)細胞受L-AP4刺激后,PI3K-Kinase p85α的表達水平與對照組相比無統(tǒng)計學差異,但GSK-3β的激活水平則被抑制,與對照組相比有統(tǒng)計學差異。(5)m Glu R I的激活可以增強M1型小膠質(zhì)細胞中l(wèi)inc RNA-COX2和linc RNA-EPS表達,與對照組相比有統(tǒng)計學差異。當M1型小膠質(zhì)細胞m Glu R III激活時,linc RNA-COX2和linc RNA-EPS的表達均有明顯下調(diào),與對照組相比有統(tǒng)計學差異。(6)M1型小膠質(zhì)細胞受DHPG的刺激以及M2型小膠質(zhì)細胞受L-AP4刺激的上清液都可以使神經(jīng)細胞的活力增加并顯著降低神經(jīng)細胞死亡與損傷,與對照組相比有統(tǒng)計學差異。(7)靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞受DHPG激活后上清液傾向于增加神經(jīng)細胞谷氨酸的釋放,而DHPG激活的M1型小膠質(zhì)細胞以及L-AP4激活的M2型小膠質(zhì)細胞的上清液都可以減少神經(jīng)細胞谷氨酸的釋放,以上數(shù)據(jù)與對照組相比均有統(tǒng)計學差異。(8)M1型小膠質(zhì)細胞當受到DHPG及L-AP4刺激時上清液可以減少神經(jīng)細胞NR1、NR2A及NR2B的活化水平并增加Ca MK II的活化水平。LY 354740激活的M1型小膠質(zhì)細胞上清液傾向于降低神經(jīng)細胞NR2B的活化水平。DHPG激活的M2型小膠質(zhì)細胞上清液可以上調(diào)NR2A及NR2B的激活水平,LY 354740激活的M2型小膠質(zhì)細胞上、清液可以抑制NR2A的激活,L-AP4激活的M2型小膠質(zhì)細胞上清液可以下調(diào)神經(jīng)細胞NR1與NR2A的活化水平。DHPG及LY 354740激活的M2型小膠質(zhì)細胞上清液可以顯著增加Ca MK II的活化水平,以上數(shù)據(jù)與對照組相比均有統(tǒng)計學差異。(9)M1型小膠質(zhì)細胞的NO產(chǎn)量較靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞相比有明顯升高,給予DHPG可以上調(diào)M1型小膠質(zhì)細胞的NO產(chǎn)量,與對照組相比有統(tǒng)計學差異。DHPG激活的M1型小膠質(zhì)細胞上清液傾向于降低神經(jīng)細胞i NOS的表達,與對照組相比有統(tǒng)計學差異。M2型小膠質(zhì)細胞在接受DHPG、LY 354740和L-AP4刺激后對NO產(chǎn)量沒有影響,與對照組相比無統(tǒng)計學差異。M2狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞受DHPG以及L-AP4激活時上清液傾向于減少神經(jīng)細胞i NOS的產(chǎn)生,與對照組相比有統(tǒng)計學差異。結論:(1)促炎狀態(tài)下小膠質(zhì)細胞m Glu R I的激活傾向于通過下調(diào)促炎性細胞因子的分泌及上調(diào)抑炎性細胞因子的釋放抑制現(xiàn)有的炎癥。m Glu R III激活可以使促炎狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞向靜息狀態(tài)轉化。而m Glu R III能誘導抑炎狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞保持激活狀態(tài)。(2)m Glu R激動劑在不同狀態(tài)下調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的多態(tài)性與MAPK-ERK-Gsk3β途徑及PI3K-Akt-Gsk3β途徑之間的拮抗關系密切相關。(3)促炎狀態(tài)下m Glu R I激活與抑炎狀態(tài)下m Glu R III激活的小膠質(zhì)細胞上清液會對神經(jīng)元具有增加細胞活力、減少細胞死亡與損傷,減少興奮性氨基酸釋放以及興奮性相關通路蛋白表達下調(diào)等作用,從而起到潛在的抗癲癇及神經(jīng)保護作用。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R742.1
【部分圖文】：

小膠質(zhì)細胞是一類可塑性非常高的細胞,可以表現(xiàn)出多種細胞形態(tài)并表達不同的細胞表面標志物。小膠質(zhì)細胞活化后可以大致分為三型:經(jīng)典活化型M1,選擇活化型M2以及M3—獲得性失活狀態(tài)[23,24]。M1型小膠質(zhì)細胞由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、細胞或細菌碎片、微生物或干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)刺激后活化形成。激活后,M1型小膠質(zhì)細胞表達多種促炎性因子/表面標志物如白細胞介素-1β(interleukin,IL-1β),IL-6,IL-12,IL-23,Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2),TLR4,趨化因子,腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α),谷氨酸和一氧化氮(nitric oxide,NO)等,還可以在細胞表面表達清道夫受體、主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)II類分子和共刺激因子等,具有促炎性作用[23,25,26]。當小膠質(zhì)細胞受到細菌、病毒或真菌等刺激時,從靜息狀態(tài)轉化而來的M1型可以殺滅外源性病原體并清除相應的細胞碎片等感染物質(zhì),募集并促進T細胞的分化,從而啟動免疫反應[25,27]。M2型小膠質(zhì)細胞則表達抑炎性因子/表面標志物,包括IL-10,IL-13,轉化生長因子β(transforming growth factorβ,TGF-β),血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),內(nèi)皮生長因子(endothelial growth factor,EGF),精氨酸1(arginase 1,Arg-1)等,起到對炎癥反應的限制并重新建立環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[28]。最近的研究表明M2型小膠質(zhì)細胞也可能包含更多可以細分的表型變異,包括M2a、M2b、M2c、M2d等。正常情況下,M1和M2處于動態(tài)平衡的狀態(tài),但在病理狀態(tài)下,這種平衡將會被打破。而在特定的情況下,不同激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞之間也可以相互轉化。例如,當M1受到IL-13,IL-10,TGF-β等因素刺激時可以向M2型小膠質(zhì)細胞轉化。事實上,很多研究已經(jīng)證明小膠質(zhì)細胞的激活是具有高度復雜性和動態(tài)性的,也有觀點認為小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)在M1和M2表型中具有一定的變化范圍,而小膠質(zhì)細胞最終會分化成為哪一表型取決于它落在該范圍的某處以及其遇到的特定的刺激信號[29-33]。靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞受到刺激后分化為不同的表型之間的關系見圖1.1。1.1.3 小膠質(zhì)細胞的谷氨酸受體

mGluR III:小膠質(zhì)細胞表面的III組谷氨酸受體可以起到保護神經(jīng)細胞并且對抗小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)毒性的作用。靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞mGluR III的激活可以與其他細胞對腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)的抑制起到協(xié)同作用,并抑制毛喉素誘導的環(huán)磷酸腺苷(Adenosine 3",5"-cyclic monophosphate,c AMP)累積的作用。當受到LPS或嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A,CGA)的刺激后,mGluR III的激活可以誘導小膠質(zhì)細胞的活化,同時引起TNF-α,MHC II和一氧化氮合酶(Nitric oxide synthases)的表達,以及通過NO誘導的減少細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸的外化來減少神經(jīng)細胞程序性死亡。mGluR III的激活還可以抑制小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞谷氨酸的釋放,同時促進星形膠質(zhì)細胞對于谷氨酸的攝取,還可以降低小膠質(zhì)細胞的免疫反應性控制神經(jīng)炎癥反應。總而言之,mGluR III的激活可以起到相對直接的神經(jīng)保護作用[36,51]。小膠質(zhì)細胞一些代表性谷氨酸受體激活后的下游通路事件見圖1.2。1.2 小膠質(zhì)細胞介導的免疫與炎癥反應與癲癇之間的聯(lián)系

(7)6小時后在顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài),若細胞狀態(tài)良好,則可分別收集各組細胞及上清液,于-20℃短期保存?zhèn)溆谩?.2.7 流式細胞術鑒定不同狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞表型
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