發(fā)布時(shí)間：2020-11-08 08:30

　　 研究背景慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML,簡稱慢粒)是一種由染色體t(9;22)易位形成BCR-ABL融合基因?yàn)樘卣鞯墓撬柙鲋承阅[瘤,BCR-ABL融合基因編碼的融合蛋白具有異常的酪氨酸激酶活性,由此激活下游信號(hào)通路導(dǎo)致疾病的發(fā)生。慢粒自然病程分為慢性期(Chronic phase,CP)、加速期(Accelerated phase,AP)和急變期(Blastphase,BP)。酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)能夠抑制BCR-ABL的酪氨酸激酶活性,是慢粒的首選治療方法,多數(shù)慢性期患者應(yīng)用TKIs治療后能夠長期生存,然而慢粒一旦急變,TKIs療效不佳,致死率極高,中位生存期僅為6個(gè)月。慢粒急變機(jī)制復(fù)雜,尚未完全闡明,因此解析慢粒急變機(jī)制及其關(guān)鍵調(diào)控分子,是有效防控慢粒急變的科學(xué)前提。慢粒急變是一個(gè)多步驟、多變化的過程,由于慢粒急變過程通常伴隨BCR-ABL高表達(dá)和過度激活狀態(tài),不受控制的BCR-ABL激活被認(rèn)為是促進(jìn)慢粒急變的驅(qū)動(dòng)力,因此,慢粒急變存在BCR-ABL依賴機(jī)制。另外,研究發(fā)現(xiàn),除癌基因的激活或擴(kuò)增、抑癌基因的功能缺失或者突變等遺傳學(xué)打擊之外,信號(hào)通路關(guān)鍵分子調(diào)控異常和表觀遺傳學(xué)失衡等也參與慢粒急變,因而慢粒急變還存在BCR-ABL非依賴途徑。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白2(RBP2)屬于KDM5家族,靶向作用于組蛋白H3第四位賴氨酸(H3-K4)的二甲基化和三甲基化(Me2/Me3),介導(dǎo)組蛋白去甲基化。同時(shí)RBP2含有一個(gè)組蛋白去甲基化酶標(biāo)志性基序的JmjC結(jié)構(gòu)域,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能,從而調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)過程。近年來,RBP2被報(bào)道參與胃癌、肺癌、乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、腎癌、卵巢癌和肝癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)RBP2在慢粒急變期表達(dá)明顯下調(diào),通過調(diào)控miR-21以BCR-ABL非依賴途徑介導(dǎo)慢粒急變的進(jìn)程。然而,R1BP2是否可以通過BCR-ABL依賴途徑介導(dǎo)慢粒急變?nèi)圆磺宄?值得進(jìn)一步研究。Lin28B是Lin28家族的一種RNA結(jié)合蛋白,可識(shí)別結(jié)合RNA3'UTR基序,從而調(diào)控靶基因的表達(dá),介導(dǎo)多種生物學(xué)功能。Lin28B在多種腫瘤中高表達(dá),包括淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤,結(jié)腸癌和肝癌等。研究發(fā)現(xiàn)Lin28B在急性髓系白血病中高表達(dá),通過調(diào)控miRNAlet-7促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖異常和細(xì)胞周期紊亂,且受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)控,在白血病干細(xì)胞維持中起關(guān)鍵作用,因此具有干預(yù)AML潛在靶點(diǎn)的特征。新近研究還發(fā)現(xiàn)Lin28B同家族的Lin28A還具有DNA結(jié)合蛋白作用。然而,目前在慢粒中尚無Lin28B相關(guān)研究,是否在慢粒急變中發(fā)揮作用也尚需探究。本研究發(fā)現(xiàn)RBP2和Lin28B在慢粒急變中表達(dá)異常,通過在細(xì)胞分子水平、動(dòng)物整體水平和人體骨髓組織水平等研究,我們發(fā)現(xiàn)組蛋白去甲基化酶RBP2以BCR-ABL依賴的途徑、RNA結(jié)合蛋白Lin28B調(diào)控miR-181d轉(zhuǎn)錄以BCR-ABL非依賴的途徑促進(jìn)慢粒急變。此為探究RBP2和Lin28B在慢粒急變中作用及其調(diào)控機(jī)制提供新的思路。研究目的:(一)探究RBP2在慢粒急變中以BCR-ABL依賴途徑介導(dǎo)的效應(yīng)與機(jī)制。(二)探究Lin28B在慢粒急變中以BCR-ABL非依賴途徑介導(dǎo)的效應(yīng)與機(jī)制。研究方法和研究結(jié)果:(一)組蛋白去甲基化酶RBP2通過調(diào)控PTEN以BCR-ABL依賴的途徑介導(dǎo)慢粒急變(1)過表達(dá)RBP2抑制白血病細(xì)胞的增殖在慢粒急變細(xì)胞K562和MEG01中轉(zhuǎn)染RBP2過表達(dá)質(zhì)粒,應(yīng)用EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測RBP2對(duì)于白血病細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果提示RBP2過表達(dá)顯著抑制白血病細(xì)胞的增殖能力。(2)檢測RBP2與BCR-ABL之間的相互作用應(yīng)用Western blot檢測BCR-ABL 陽性細(xì)胞系(K562和MEG01)與BCR-ABL陰性細(xì)胞系(HL60和U937)中RBP2的表達(dá)。結(jié)果提示RBP2在BCR-ABL陽性細(xì)胞系中表達(dá)水平明顯低于BCR-ABL陰性細(xì)胞系中表達(dá),提示RBP2與BCR-ABL存在相關(guān)性。在K562細(xì)胞、MEG01細(xì)胞和慢粒患者原代細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RBP2過表達(dá)質(zhì)粒,應(yīng)用Western blot和qRT-PCR的方法檢測,發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)RBP2后,BCR-ABL的活性形式,即磷酸化BCR-ABL(p-BCR-ABL)水平明顯降低,而BCR-ABL的總蛋白水平和mRNA水平并未見明顯降低,提示RBP2在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控BCR-ABL的磷酸化水平。(3)探究RBP2調(diào)控磷酸化BCR-ABL(p-BCR-ABL)的機(jī)制在K562和MEG01細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RBP2過表達(dá)質(zhì)粒后,應(yīng)用qRT-PCR方法檢測調(diào)控磷酸化相關(guān)分子PTEN、SHP1、PP2A、SET和PTP1B的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)僅PTEN的mRNA表達(dá)水平明顯升高。在齊魯醫(yī)院收集42例慢粒慢性期和急變期患者骨髓標(biāo)本,應(yīng)用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)RBP2和PTEN的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。進(jìn)一步在K562和MEG01細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RBP2過表達(dá)質(zhì)粒,用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)PTEN的蛋白水平明顯上升。在慢粒患者骨髓細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RBP2過表達(dá)質(zhì)粒,應(yīng)用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)PTEN的mRNA水平隨之上升。提取雜合型敲基因小鼠與野生型小鼠的骨髓細(xì)胞,應(yīng)用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)隨著RBP2表達(dá)下調(diào),PTEN的表達(dá)水平也明顯降低。以上結(jié)果說明,RBP2在慢�；颊咴�(xì)胞、慢粒急變細(xì)胞系和小鼠體內(nèi)均能轉(zhuǎn)錄調(diào)控PTEN的表達(dá)。(4)探究RBP2調(diào)控PTEN表達(dá)的機(jī)制分別將空載質(zhì)粒、RBP2過表達(dá)野生型質(zhì)粒和RBP2酶活性突變的過表達(dá)質(zhì)粒(RBP2 H483A)轉(zhuǎn)染進(jìn) K562 和 MEG01 細(xì)胞中,應(yīng)用 Western blot 及 qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)野生型RBP2過表達(dá)質(zhì)粒能夠顯著上調(diào)PTEN的mRNA和蛋白水平,而酶活性突變的過表達(dá)質(zhì)粒RBP2H483A不影響PTEN表達(dá),說明RBP2調(diào)控PTEN的表達(dá)依賴其去甲基化酶活性。在K562細(xì)胞中應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RBP2能夠結(jié)合在PTEN啟動(dòng)子區(qū)域。隨后在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RBP2過表達(dá)質(zhì)粒后進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn),結(jié)果提示隨著RBP2過表達(dá),RBP2在PTEN啟動(dòng)子區(qū)域富集明顯增加,而H3K4me2和H3K4me3在PTEN啟動(dòng)子區(qū)域富集明顯減少。提示RBP2結(jié)合在PTEN啟動(dòng)子區(qū)域依賴其去甲基化酶活性。在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RBP2過表達(dá)質(zhì)�；蛘逺BP2 H483A質(zhì)粒后,共轉(zhuǎn)染PTEN啟動(dòng)子或者PTEN啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)突變的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,進(jìn)行雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)。檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RBP2后PTEN啟動(dòng)子活性明顯升高,而RBP2 H483A對(duì)PTEN啟動(dòng)子活性沒有明顯影響,RBP2過表達(dá)質(zhì)粒和RBP2H483A質(zhì)粒對(duì)于結(jié)合位點(diǎn)突變型PTEN啟動(dòng)子活性均沒有明顯影響。以上結(jié)果說明RBP2可以調(diào)控PTEN啟動(dòng)子活性,且該作用依賴于其去甲基化酶活性。(5)PTEN調(diào)控磷酸化BCR-ABL(p-BCR-ABL)表達(dá)的機(jī)制研究在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PTEN siRNA和MEG01細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PTEN過表達(dá)質(zhì)粒,應(yīng)用Westernblot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測,發(fā)現(xiàn)隨著PTEN表達(dá)降低,BCR-ABL、STAT5和ERK的磷酸化水平均明顯上升,而過表達(dá)PTEN后,BCR-ABL、STAT5和ERK的磷酸化水平則明顯降低,BCR-ABL的mRNA表達(dá)水平并未隨著PTEN的變化而改變。在K562細(xì)胞和共轉(zhuǎn)染BCR-ABL與PTEN過表達(dá)質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞中,進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí)內(nèi)源性和外源性的PTEN與BCR-ABL均可以相互結(jié)合。說明PTEN是通過與BCR-ABL相互結(jié)合,介導(dǎo)BCR-ABL去磷酸化。(6)BCR-ABL調(diào)控RBP2的表達(dá)水平分別在不同時(shí)間或不同濃度伊馬替尼(IM)處理K562細(xì)胞后,進(jìn)行Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)伴隨伊馬替尼(IM)處理時(shí)間的延長或者濃度的提高,RBP2的mRNA和蛋白水平呈現(xiàn)逐步上升的趨勢,提示抑制BCR-ABL激酶活性能夠誘導(dǎo)RBP2的表達(dá)。進(jìn)一步在K562細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染BCR-ABL siRNA或者BCR-ABL過表達(dá)質(zhì)粒,然后應(yīng)用Western blot及qRT-PCR方法檢測RBP2及BCR-ABL的mRNA及蛋白表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)改變BCR-ABL的表達(dá)后,RBP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平受到BCR-ABL的負(fù)性調(diào)控,表明BCR-ABL能夠在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)性調(diào)控RBP2的表達(dá)。(7)RBP2通過BCR-ABL依賴途徑調(diào)控白血病細(xì)胞增殖在K562和MEG01細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染RBP2過表達(dá)質(zhì)粒與BCR-ABL過表達(dá)質(zhì)粒、單獨(dú)轉(zhuǎn)染RBP2過表達(dá)質(zhì)粒或者空載質(zhì)粒,應(yīng)用EdU和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測白血病細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果提示過表達(dá)RBP2抑制白血病細(xì)胞增殖,而過表達(dá)BCR-ABL可以逆轉(zhuǎn)RBP2過表達(dá)對(duì)于細(xì)胞增殖的抑制能力,說明RBP2抑制白血病細(xì)胞的增殖主要通過BCR-ABL通路。(二)RNA結(jié)合蛋白Lin28B通過調(diào)控miR-181d以BCR-ABL非依賴途徑介導(dǎo)慢粒急變(1)Lin28B的表達(dá)在慢粒急變中明顯上升在GEO數(shù)據(jù)庫GSE4170數(shù)據(jù)集中,比較29種RNA結(jié)合蛋白在慢粒慢性期和急變期的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白Lin28B在慢粒急變中變化最為明顯。在齊魯醫(yī)院收集的慢粒慢性期和急變期患者骨髓標(biāo)本,應(yīng)用qRT-PCR和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)Lin28B的mRNA和蛋白表達(dá)水平在急變期相較于慢性期都明顯上升,提示Lin28B可能參與了慢粒急變的進(jìn)程。(2)檢測Lin28B對(duì)于慢粒急變細(xì)胞增殖的影響應(yīng)用慢病毒感染K562和MEG01細(xì)胞系構(gòu)建Lin28B穩(wěn)定敲除的細(xì)胞系,應(yīng)用EdU實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)在敲除Lin28B后,白血病細(xì)胞增殖能力明顯下降。(3)檢測Lin28B與白血病細(xì)胞分化之間的關(guān)系分別用DMSO和PMA處理K562和MEG01細(xì)胞誘導(dǎo)其向巨噬細(xì)胞樣和粒細(xì)胞樣分化,應(yīng)用Western blot和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,Lin28B的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降,說明Lin28B參與白血病細(xì)胞分化受阻。(4)探究Lin28B調(diào)控miR-181d的機(jī)制應(yīng)用慢病毒感染K562和MEG01細(xì)胞系,構(gòu)建Lin28B穩(wěn)定干擾細(xì)胞系,應(yīng)用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)隨著Lin28B表達(dá)下降,miR-181d的表達(dá)水平也明顯下降。提示miR-181d是Lin28B的潛在靶基因。在K562和HL60細(xì)胞中進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn),檢測發(fā)現(xiàn)Lin28B能夠結(jié)合在miR-181d的啟動(dòng)子區(qū)域。然后在K562和HL60細(xì)胞中敲除Lin28B的表達(dá),進(jìn)行雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Lin28B敲除后miR-181d啟動(dòng)子的熒光素酶活性明顯降低。以上結(jié)果說明,Lin28B結(jié)合在miR-181d啟動(dòng)子區(qū)域激活其轉(zhuǎn)錄。(5)miR-181d直接調(diào)控靶基因PDCD4表達(dá)的機(jī)制在 K562 和 HL60 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染 miR-181d mimics 或者 miR-181d inhibitor或者相對(duì)應(yīng)的對(duì)照,應(yīng)用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)升高miR-181d的表達(dá)后,PDCD4的蛋白水平可見顯著下降。反之,降低miR-181d表達(dá)后,PDCD4的蛋白水平明顯上升。提示PDCD4是miR-181d的潛在靶基因。隨后,構(gòu)建PDCD43'UTR以及PDCD43'UTRmut(結(jié)合位點(diǎn)突變)雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。在K562和HL60細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染miR-181d mimics、miR-181d inhibitor或者相應(yīng)的對(duì)照,共轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)提示過表達(dá)miR-181d抑制PDCD4 3'UTR熒光素酶的活性,降低miR-181d的表達(dá)則會(huì)上調(diào)PDCD4 3'UTR熒光素酶的活性,而miR-181d表達(dá)變化對(duì)結(jié)合位點(diǎn)突變的PDCD4 3'UTR mut熒光素酶活性并沒有明顯影響。以上結(jié)果說明miR-181d通過結(jié)合在PDCD4 3'UTR調(diào)控PDCD4的表達(dá)。(6)NOD-SCID小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明敲除Lin28B能夠抑制白血病細(xì)胞生長應(yīng)用亞致死劑量的X射線輻射NOD-SCID小鼠,24小時(shí)后將1 × 1 06個(gè)Lin28B穩(wěn)定敲除K562細(xì)胞以及對(duì)照K562細(xì)胞分別皮下注射在小鼠兩側(cè)腋窩,每隔3天測量一次腫瘤體積,于18天后處死小鼠,測量腫瘤重量。結(jié)果提示Lin28B敲除組小鼠腫瘤體積生長速度和重量明顯小于對(duì)照組,說明在體內(nèi)敲除Lin28B能夠抑制白血病細(xì)胞的增殖能力。研究結(jié)論:1.發(fā)現(xiàn)組蛋白去甲基化酶RBP2通過結(jié)合在PTEN啟動(dòng)子區(qū)域激活其轉(zhuǎn)錄;PTEN與BCR-ABL相互結(jié)合,介導(dǎo)BCR-ABL去磷酸化;由此構(gòu)成“RBP2/PTEN/BCR-ABL”調(diào)控軸,以BCR-ABL依賴途徑介導(dǎo)慢粒急變。2.發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白Lin28B通過結(jié)合在miR-181d啟動(dòng)子區(qū)域激活其轉(zhuǎn)錄,miR-181d表達(dá)水平增高;miR-181d結(jié)合于PDCD4 3'UTR區(qū)域,抑制PDCD4的表達(dá);由此構(gòu)成“Lin28B/miR-181d/PDCD4”調(diào)控軸,以BCR-ABL非依賴途徑介導(dǎo)慢粒急變。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R733.72
【部分圖文】：

?山東大學(xué)博士學(xué)位論文???實(shí)驗(yàn)結(jié)果??３．１?ＲＢＰ２過表達(dá)抑制慢粒急變白血病細(xì)胞增殖??在Ｋ５６２和ＭＥＧ０１細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ＲＢＰ２過表達(dá)質(zhì)粒后檢測細(xì)胞增殖能力。ＥｄＵ??與軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染ＲＢＰ２過??表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞增殖能力顯著降低（圖１Ａ－Ｂ）和細(xì)胞克隆形成能力明顯降低（圖??１Ｃ－Ｄ）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了?ＲＢＰ２過表達(dá)抑制白血病細(xì)胞的增殖能力。??Ａ?ＤＡＰＩ??ＥｄＵ??Ｍｅｒｇｅ?Ｂ??Ｖｅｃｔｏｒ??ＳＳＰＣＳ＾Ｓｌ?□?ｖｅｃｔｏｒ??—ＰＨ?ｒ。］?ｐ?＾??ｖｅｃ，〇ｒ?ｔ?ｊｌＪＩ?ＩＩ??Ｋ５Ｇ２?＾??刪■■■??Ｖｅｃｔｏｒ?ＲＢＰ２??Ｃ?？琢?ｋ、?Ｄ?□?Ｖｅｃｔｏｒ??＿?ｔ?：卜奪ｐ??．，＇?ｉ?５。．?＿?廣—??－°?Ｊ?Ｕ．Ｉ?ｌ?！，■??圖１．ＲＢＰ２過表達(dá)抑制慢粒急變白血病細(xì)胞增殖能力：（Ａ）轉(zhuǎn)染ＲＢＰ２過表達(dá)質(zhì)粒??進(jìn)ＭＥＧ０１和Ｋ５６２細(xì)胞，然后應(yīng)用ＥｄＵ實(shí)驗(yàn)檢測白血病細(xì)胞的增殖情況。（Ｂ）圖Ａ的ＥｄＵ??陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。（Ｃ）將ＲＢＰ２過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)ＭＥＧ０１和Ｋ５６２細(xì)胞，然后進(jìn)行軟??瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的克隆形成能力。（Ｄ）細(xì)胞克隆形成數(shù)目計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。（＊＊Ｐ＜０．０１，??＊?＊?＊?Ｐ＜?０．００１?）??３．２過表達(dá)ＲＢＰ２抑制ＢＣＲ－ＡＢＬ的磷酸化過程??（１）?ＲＢＰ２與ＢＣＲ－ＡＢＬ之間存在相關(guān)性??４２??

低，低表達(dá)的ＲＢＰ２通過調(diào)控ｍｉＲ－２１的表達(dá)以ＢＣＲ－??ＡＢＬ非依賴的途徑促進(jìn)慢粒急變［４１］。由于ＢＣＲ－ＡＢＬ的過度激活是慢粒急變的??驅(qū)動(dòng)力，ＲＢＰ２能否通過ＢＣＲ－ＡＢＬ依賴的途徑發(fā)揮作用尚不清楚。為了探尋??ＲＢＰ２與ＢＣＲ－ＡＢＬ之間的關(guān)聯(lián)，我們比較了?ＢＣＲ－ＡＢＬ陽性細(xì)胞系（Ｋ５６２和??ＭＥＧ０１細(xì)胞系）和陰性細(xì)胞系（ＨＬ６０和Ｕ９３７細(xì)胞系）中ＲＢＰ２的表達(dá)水平，??發(fā)現(xiàn)ＲＢＰ２的蛋白表達(dá)水平在ＢＣＲ－ＡＢＬ陽性細(xì)胞系中明顯高于ＢＣＲ－ＡＢＬ陰性??細(xì)胞系中（圖２Ａ－Ｂ），說明ＲＢＰ２與ＢＣＲ－ＡＢＬ之間存在關(guān)聯(lián)。??Ａ?＿Ｂｇｇ＾±?ｂｃｒ－ａｂｌｍ?Ｂ?§１?ｔｔｏｎ??Ｕ９３７?ＨＬ６０?Ｋ５６２?ＭＥＧ０１??讀禱ｇ＂?一?ｆＩ?？］??ＡＣＴ１Ｎ?，?ｒ￣?Ｉ?Ｉ?｜｜?Ｉ?ｊ??％?１?０５?圖?＿??１１?．．．＿??１１?ｚ?＃??圖２．?ＲＢＰ２的蛋白表達(dá)水平在ＢＣＲ－ＡＢＬ陽性細(xì)胞系中明顯低于ＢＣＲ－ＡＢＬ陰??性細(xì)胞系：（Ａ）應(yīng)用ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ檢測多種白血病細(xì)胞系中ＲＢＰ２蛋白表達(dá)水平，以ＡＣＴＩＮ??為內(nèi)參。（Ｂ）使用丨ｍａｇｅ?Ｊ程序量化蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，以ＡＣＴＩＮ為內(nèi)參歸一化。??（２）?ＲＢＰ２調(diào)控ＢＣＲ－ＡＢＬ的磷酸化水平??為探宄ＲＢＰ２與ＢＣＲ－ＡＢＬ之間可能存在的關(guān)聯(lián)，我們?cè)冢耍担叮埠停停牛牵埃??細(xì)胞中過表達(dá)ＲＢＰ２，結(jié)果提示隨著ＲＢＰ２的過表達(dá)，ＢＣＲ－ＡＢＬ的總蛋白量（圖??３Ａ－Ｃ）和ｍＲＮＡ表達(dá)水平（圖３Ｄ）沒有明顯變化，但是ＢＣＲ－ＡＢＬ磷酸化水平??明顯降低（圖３Ａ－Ｃ）。從齊魯醫(yī)院收集一例慢粒慢性期患者骨髓標(biāo)本提取單個(gè)核?

?山東大學(xué)博士學(xué)位論文???Ｄ?□?ＭＥＧＯｌＷｅｃｔｏｒ?Ｆ??〇?ＭＥＧ０１＋ＲＢＰ２?＜?ＣＺ３?ＣＭＬ－ＣＰ＋Ｖｅｃｔｏｒ??￥?ｍ?Ｋ５６２＋Ｖｅｃｔｏｒ?ｇ?ｍ?ＣＭＬ－ＣＰ＋ＲＢＰ２??ＯＨ?■■?Ｋ５６２＋ＲＢＰ２?ｇ??ｎ?＆?Ａ?°?１．５．?■?ｎｓ??ＨＨＩ?ｉｉＱＩ．．?〇■??Ｉ?〇．〇?Ｉ?．．．．．．．ｕＩＭＭ?Ｍ?■?１?皮?＾??１?，?ｆ?，??圖３．?ＲＢＰ２過表達(dá)抑制ＢＣＲ－ＡＢＬ磷酸化：（Ａ）將ＲＢＰ２過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)ＭＥＧ０１和??１＜５６２細(xì)胞中，應(yīng)用＼＾５１６１１１８１〇１檢測１＾卩２、８０１１－八８［和？－８０１－八８［蛋白水平，以八（：�。埃В�??為內(nèi)參。（Ｂ，?Ｃ）應(yīng)用Ｉｍａｇｅ?Ｊ程序定量蛋白相對(duì)表達(dá)水平，以ＡＣＴＩＮ為內(nèi)參歸一化。（Ｄ）將??ＲＢＰ２過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)ＭＥＧ０１和Ｋ５６２細(xì)胞中，應(yīng)用ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測ＲＢＰ２和ＢＣＲ－ＡＢＬ??ｍＲＮＡ水平。（Ｅ）原代細(xì)胞取自ＣＭＬ患者骨髓，轉(zhuǎn)染ＲＢＰ２過表達(dá)質(zhì)粒，應(yīng)用ｑＲＴ－ＰＣＲ檢??測?ＲＢＰ２?和?ＢＣＲ－ＡＢＬｍＲＮＡ?７尺平。（＊＊Ｐ＜０‘０Ｌ?＊＊＊Ｐ?＜０?．００１，ｎｓ?Ｐ＞０．０５）??３．３?ＰＴＥＮ?是?ＲＢＰ２?的｜Ｅ基因??（１）?ＲＢＰ２與ＰＴＥＮ的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系??目前尚沒有ＲＢＰ２直接調(diào)控蛋白磷酸化的相關(guān)報(bào)道。于是，我們推測ＲＢＰ２??調(diào)控ＢＣＲ－ＡＢＬ磷酸化途徑可能是通過間接途徑。為驗(yàn)證這一推測，我們查找了??在慢粒急變中發(fā)揮作用的磷酸化過程相關(guān)分子，例如ＰＰ２Ａ，ＳＥＴ，?ＳＨＰ１，ＰＴＰ１Ｂ??和ＰＴＥＮ。在Ｋ５６２和ＭＥＧ０１細(xì)胞中過表達(dá)ＲＢ
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