【目的】建立純化細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗的方法,并從分子水平、蛋白水平及糖基化水平研究MDCK細(xì)胞基質(zhì)與雞胚基質(zhì)制備的H1N1病毒HA蛋白生物學(xué)特性的差異,系統(tǒng)性評(píng)價(jià)這些生物學(xué)特性的變化對(duì)于病毒的免疫原性和疫苗的效果的影響�！痉椒ā坎捎肕DCK懸浮細(xì)胞平臺(tái)技術(shù),分別培養(yǎng)流感病毒H1N1、H3N2、BV及BY,通過(guò)多步純化獲得較純的抗原,制備方式包括低速離心、分子篩純化、離子交換純化、廣譜核酸酶添加,制備成細(xì)胞基質(zhì)單價(jià)H1N1疫苗及細(xì)胞基質(zhì)四價(jià)流感疫苗,同時(shí)與雞胚基質(zhì)制備的單價(jià)H1N1疫苗及四價(jià)疫苗進(jìn)行比較研究。進(jìn)一步處理單價(jià)H1N1疫苗,將其去糖基化,制備成去糖基化的細(xì)胞基質(zhì)和雞胚基質(zhì)單價(jià)H1N1疫苗。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)比較單價(jià)和四價(jià)疫苗之間免疫原性差異并對(duì)其免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí),通過(guò)核酸測(cè)序比較兩種基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒HA核酸序列的差異;通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)比較HA蛋白氨基酸序列、糖基化位點(diǎn)和糖基化修飾的差異;通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)比較接種后小鼠血清中細(xì)胞因子及脾臟細(xì)胞中免疫細(xì)胞分化的差異,分析上述生物學(xué)特性的差異對(duì)疫苗免疫原性的影響。在動(dòng)物試驗(yàn)中本文還系統(tǒng)性比較了兩種疫苗對(duì)于不同類型免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)能力,及劑量對(duì)于疫苗有效性的影響�！窘Y(jié)果】純化結(jié)果顯示,該純化策略適用于四種病毒,病毒液中的宿主蛋白去除率均高于90%,宿主DNA去除率均高于90%,血凝素回收率均高于40%,在一系列純化后添加廣譜核酸酶能進(jìn)一步去除殘留DNA。在生物學(xué)特性試驗(yàn)中,兩種基質(zhì)培養(yǎng)的流感病毒HA核酸序列一致;HA蛋白氨基酸組成與理論序列覆蓋率均高于94%;雞胚基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N103、N178、N303、N497處均發(fā)現(xiàn)糖基化,細(xì)胞基質(zhì)制備的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N178、N292、N497處有糖基化,細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)的病毒在N103和N303處糖基化位點(diǎn)的缺失是由脫酰胺作用造成的;經(jīng)過(guò)糖型分析發(fā)現(xiàn),細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒HA蛋白的糖基化修飾更加復(fù)雜,多天線糖基化修飾所占比例更高,雞胚基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒HA蛋白中糖基修飾比較單一,主要是高甘露糖及去巖藻糖基聚糖。細(xì)胞免疫及天然免疫相關(guān)多細(xì)胞因子組動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示,小鼠在接種細(xì)胞基質(zhì)制備的流感疫苗后的6小時(shí)內(nèi),血清中MCP-1、IP-10及IL-6濃度顯著升高,說(shuō)明小鼠的天然免疫反應(yīng)被激活,而雞胚基質(zhì)流感疫苗和去糖基化流感疫苗所引起的細(xì)胞因子變化無(wú)顯著性差異,說(shuō)明HA蛋白上的糖基化是誘導(dǎo)天然免疫的因素之一;體液免疫相關(guān)多因子組動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示,各組小鼠在接種10天后,血清中的IL-4、IL-5及IL-10濃度無(wú)顯著性差異,說(shuō)明不同基質(zhì)的流感疫苗及去糖基化流感疫苗在誘導(dǎo)體液免疫能力上差異較小;胞內(nèi)細(xì)胞因子染色試驗(yàn)結(jié)果顯示不同疫苗組之間B細(xì)胞所占比例無(wú)顯著性差異,進(jìn)一步說(shuō)明不同基質(zhì)流感疫苗在誘導(dǎo)體液免疫能力上差異不大,而細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗能更有效的激活CD8+T細(xì)胞的分化,且分泌TNF-α、IFN-γ及IL-2的T細(xì)胞所占比例顯著高于其雞胚基質(zhì)疫苗和去糖基化流感疫苗組,說(shuō)明細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗可誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng),同時(shí)也說(shuō)明糖基化的去除顯著降低了疫苗的免疫原性及免疫效果;在體外中和試驗(yàn)中,小鼠在接種第二針疫苗后血清中具有中和活性的抗體顯著增加,且細(xì)胞基質(zhì)疫苗組小鼠的血清中和效價(jià)顯著高于雞胚基質(zhì)疫苗和去糖基化疫苗組,但是在血凝抑制試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)雞胚基質(zhì)疫苗組的血清保護(hù)能力略高于細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗組,這兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果的矛盾可能與病毒的培養(yǎng)基質(zhì)有關(guān);在細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗組中比較了低、較低、中、高四個(gè)不同劑量,結(jié)果顯示高劑量組誘導(dǎo)天然免疫、細(xì)胞免疫及體液免疫的能力顯著強(qiáng)于中、低劑量組,說(shuō)明增加劑量對(duì)細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗所產(chǎn)生的免疫保護(hù)結(jié)果有顯著影響�！窘Y(jié)論】本課題摸索了一套可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗純化策略,該方法可有效去除宿主蛋白和DNA,且在不添加廣譜核酸酶的條件下宿主DNA殘留量達(dá)到歐洲藥典中核酸殘留質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在HA蛋白生物學(xué)特性的研究中發(fā)現(xiàn)其糖基化位點(diǎn)與糖基化修飾會(huì)受到培養(yǎng)基質(zhì)的影響,在細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的糖基化位點(diǎn)N292,但是該位點(diǎn)處于HA蛋白莖部不屬于抗原表位區(qū)域,且保守性評(píng)分較低,說(shuō)明并可能未處在受體結(jié)合區(qū)域,所以對(duì)于病毒的免疫原性影響仍需進(jìn)一步確定;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒HA上處于受體結(jié)合區(qū)域的幾個(gè)糖基化位點(diǎn)的糖基化修飾存在顯著差異,因HA蛋白球狀頭部的糖蛋白在病毒侵染細(xì)胞時(shí)起關(guān)鍵的識(shí)別作用,所以這些位置的糖基化差異有可能導(dǎo)致病毒免疫原性的變化,這說(shuō)明HA蛋白上的多天線糖基化修飾和更加復(fù)雜的糖基化修飾可能是導(dǎo)致流感病毒免疫原性差異的重要原因。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)的流感病毒在N103和N303處糖基化缺失是由于脫酰胺作用造成,脫酰胺作用能使蛋白質(zhì)的局部疏水性發(fā)生變化,影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),這與培養(yǎng)基質(zhì)的pH值、離子種類、離子強(qiáng)度密切相關(guān),說(shuō)明哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境可能是造成病毒糖蛋白趨向保守的主要原因。在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)糖基化的存在對(duì)于疫苗誘導(dǎo)天然免疫和細(xì)胞免疫有顯著影響,說(shuō)明HA蛋白的糖基化在誘導(dǎo)機(jī)體的天然免疫和細(xì)胞免疫時(shí)起到一定作用,這可能是因?yàn)榧?xì)胞基質(zhì)中流感病毒HA糖基化修飾使得病毒更容易被天然免疫和細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞識(shí)別。體液相關(guān)細(xì)胞因子的分泌情況與B細(xì)胞分化情況說(shuō)明不同基質(zhì)制備的流感疫苗的誘導(dǎo)體液免疫能力較為一致,但是動(dòng)物試驗(yàn)中的體外中和試驗(yàn)結(jié)果與血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果存在矛盾,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于體外中和試驗(yàn)中所用的細(xì)胞就是培養(yǎng)流感病毒的MDCK細(xì)胞,所以小鼠血清中抗體特異性更強(qiáng),導(dǎo)致血清的中和效價(jià)更高,而血凝抑制所用的材料為雞血紅細(xì)胞,在結(jié)合雞胚基質(zhì)培養(yǎng)的流感病毒時(shí)能力更強(qiáng),導(dǎo)致血凝實(shí)驗(yàn)中雞胚基質(zhì)疫苗組結(jié)果更好,同時(shí)上述兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明在檢定兩種基質(zhì)流感疫苗時(shí)應(yīng)區(qū)分別建立特異性檢定方法才能獲得更準(zhǔn)確的檢定結(jié)果。
【學(xué)位單位】：武漢生物制品研究所
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R392-33
【部分圖文】：

武漢生物制品研究所2020屆博士研究生畢業(yè)論文4三個(gè)主要部分組成。包膜蛋白由三種跨膜蛋白修飾：HA、NA和基質(zhì)蛋白2（MatrixProtein2,M2），其中HA和NA均為囊膜糖蛋白，是體液免疫反應(yīng)所針對(duì)的關(guān)鍵抗原，M2蛋白則起到離子通道作用，在病毒包膜外的HA和NA具有頂端分選信號(hào)[4]，并利離子通道進(jìn)行細(xì)胞表面運(yùn)輸和頂端分選，HA蛋白作為流感病毒上一種極為重要的包膜蛋白，是一種突出于病毒表面的蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞的附著、病毒的內(nèi)化以及病毒衣殼與細(xì)胞核內(nèi)體膜的融合[5]，HA蛋白的結(jié)構(gòu)可分為球狀頭部（HA1）和跨膜的莖部（HA2），即使在同一亞型中流感病毒的HA1部分也會(huì)產(chǎn)生較大變異，莖部則相對(duì)保守；基質(zhì)蛋白則處于中間層，主要是基質(zhì)蛋白1（MatrixProtein1,M1）構(gòu)建起整個(gè)病毒的骨架；核心由聚合酶堿性蛋白1和2（PolymeraseBasicProtein1，PB1;PolymeraseBasicProtein2,PB2）、核蛋白（Nucleoprotein）和負(fù)鏈病毒RNA組成最內(nèi)層螺旋狀病毒核糖核衣殼蛋白（vRNP）。除此之外，病毒顆粒中還含有非結(jié)構(gòu)蛋白2（NonstructuralProtein2，NS2）等蛋白。病毒的結(jié)構(gòu)如圖1所示。圖1.1流感病毒結(jié)構(gòu)示意圖Fig1.1Influenzavirusstructure流感疫苗的變異主要由抗原漂移（AntigenicDrift）及抗原轉(zhuǎn)換（AntigenicShift）引起�？乖剖侵覆《竞塑账嵛稽c(diǎn)的突變而導(dǎo)致的氨基酸的改變，某些關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸變化則會(huì)導(dǎo)致病毒的抗原性發(fā)生變化。這是因?yàn)榱鞲胁《緦儆赗NA病毒，而RNA病毒的聚合酶的校正閱讀能力是缺失的，所以在病毒復(fù)制過(guò)

武漢生物制品研究所2020屆博士研究生畢業(yè)論文7圖1.2中國(guó)2017.06至2019.09流感發(fā)病人數(shù)統(tǒng)計(jì)圖Fig1.2NumberofinfluenzacasesinChinafromJune2017toSeptember2019大規(guī)模的流感流行均是由甲型流感病毒引起的，季節(jié)性流感則主要由甲型和乙型兩種病毒引起。根據(jù)2017年美國(guó)監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)于美國(guó)31個(gè)流感流行季的統(tǒng)計(jì)，H3N2主導(dǎo)了其中22個(gè)，而這期間流感的致病率和致死率是非H3N2流行季的2.7倍[27]。相比甲型，乙型的流感病毒更加穩(wěn)定，乙型Yamagata株和乙型Victoria株已經(jīng)流行40余年，還保持著流行株的主導(dǎo)位置[28]。流感與普通感冒在癥狀上類似，都伴隨著乏力、頭疼、咳嗽甚至高熱等，但是普通感冒引發(fā)的癥狀在幾天后會(huì)開(kāi)始減輕，而流感則容易變得嚴(yán)重。嚴(yán)重的流感會(huì)引起：病毒型肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、休克、哮喘、充血性心力衰竭、繼發(fā)細(xì)菌性肺炎、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等多種并發(fā)癥，最嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡[29,30]。抵抗力較差的人群，如老年人、兒童或有較嚴(yán)重病灶的患者，在感染流感病毒后容易發(fā)展為重癥。雖然上述人群更易感染流感，但是流感仍可以影響各個(gè)年齡層，因?yàn)獒t(yī)療資源使用的增加和損失的生產(chǎn)力，每年的流感都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題[31]，特別是在低收入國(guó)家和中等收入國(guó)家[32]。

武漢生物制品研究所2020屆博士研究生畢業(yè)論文9圖1.3流感病毒與對(duì)應(yīng)疫苗發(fā)展歷程Fig1.3Developmentofinfluenzavirusandcorrespondingvaccine1.3.1早期的流感疫苗1936年蘇聯(lián)的Smorodintseff將流感病毒在雞胚中傳代30次，發(fā)現(xiàn)這種多次傳代的病毒對(duì)于實(shí)驗(yàn)者只會(huì)引起輕微的發(fā)熱，因此這種方法被用來(lái)制備流感減毒活疫苗，并廣泛使用在工人中[39]。同時(shí)代其他國(guó)家的資料顯示流感減毒活疫苗在傳代至足夠安全時(shí)，對(duì)于沒(méi)有天然免疫的青壯年有著較好的保護(hù)力，但是對(duì)于兒童和老人疫苗能提供的保護(hù)則很有限[40-42]。但是受制于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件，流感減毒活疫苗仍存在隱患，如減毒株的穩(wěn)定性、減毒株與野毒株重組的風(fēng)險(xiǎn)等。目前減毒活疫苗在美國(guó)等國(guó)家仍在使用，但是僅被用于免疫力較強(qiáng)的2~7歲兒童。美國(guó)和英國(guó)在二戰(zhàn)期間開(kāi)始研發(fā)流感滅活疫苗，主要是為軍隊(duì)提供保障[43]。在雞胚尿囊液中培養(yǎng)流感病毒是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的方法，澳大利亞的Burnet等人以此為基礎(chǔ)開(kāi)始制備流感疫苗[44]。美國(guó)的ThomasFrancis利用純化手段在雞胚尿囊液中獲得了高濃度的病毒液，并用福爾馬林進(jìn)行滅活，從而制備了流感滅活疫苗[45]。同時(shí)使用的H1N1（PR8）株因?yàn)樵谀蚰乙褐袕?fù)制能力比減毒株強(qiáng)，病毒的收獲量也隨之增大，極大地增加了疫苗的產(chǎn)量。早期流感病毒疫苗均為全病毒疫苗，副反應(yīng)嚴(yán)重，1968年巴斯德公司首次使用裂解的方式制備流感疫苗，裂解后除去病毒核酸和不需要的大分子蛋白，僅保留抗原性較強(qiáng)的HA,NA,M及NP蛋白，這使接種后的不良反應(yīng)大大減少。1976年亞單位疫苗成功被研發(fā)，該技術(shù)生產(chǎn)的流感疫苗僅含有HA和NA蛋白，有效抗原含量進(jìn)一步提升。1.3.2雞胚基質(zhì)流感疫苗雞胚基質(zhì)流感疫苗是自流感疫苗誕生以來(lái)一直使用的方法，1944年Stanley等人撰寫(xiě)了雞胚基質(zhì)流?
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2870185