【目的】建立純化細胞基質(zhì)流感疫苗的方法,并從分子水平、蛋白水平及糖基化水平研究MDCK細胞基質(zhì)與雞胚基質(zhì)制備的H1N1病毒HA蛋白生物學(xué)特性的差異,系統(tǒng)性評價這些生物學(xué)特性的變化對于病毒的免疫原性和疫苗的效果的影響�！痉椒ā坎捎肕DCK懸浮細胞平臺技術(shù),分別培養(yǎng)流感病毒H1N1、H3N2、BV及BY,通過多步純化獲得較純的抗原,制備方式包括低速離心、分子篩純化、離子交換純化、廣譜核酸酶添加,制備成細胞基質(zhì)單價H1N1疫苗及細胞基質(zhì)四價流感疫苗,同時與雞胚基質(zhì)制備的單價H1N1疫苗及四價疫苗進行比較研究。進一步處理單價H1N1疫苗,將其去糖基化,制備成去糖基化的細胞基質(zhì)和雞胚基質(zhì)單價H1N1疫苗。通過動物試驗比較單價和四價疫苗之間免疫原性差異并對其免疫效果進行評價。同時,通過核酸測序比較兩種基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒HA核酸序列的差異;通過質(zhì)譜檢測比較HA蛋白氨基酸序列、糖基化位點和糖基化修飾的差異;通過動物試驗比較接種后小鼠血清中細胞因子及脾臟細胞中免疫細胞分化的差異,分析上述生物學(xué)特性的差異對疫苗免疫原性的影響。在動物試驗中本文還系統(tǒng)性比較了兩種疫苗對于不同類型免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)能力,及劑量對于疫苗有效性的影響�！窘Y(jié)果】純化結(jié)果顯示,該純化策略適用于四種病毒,病毒液中的宿主蛋白去除率均高于90%,宿主DNA去除率均高于90%,血凝素回收率均高于40%,在一系列純化后添加廣譜核酸酶能進一步去除殘留DNA。在生物學(xué)特性試驗中,兩種基質(zhì)培養(yǎng)的流感病毒HA核酸序列一致;HA蛋白氨基酸組成與理論序列覆蓋率均高于94%;雞胚基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N103、N178、N303、N497處均發(fā)現(xiàn)糖基化,細胞基質(zhì)制備的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N178、N292、N497處有糖基化,細胞基質(zhì)培養(yǎng)的病毒在N103和N303處糖基化位點的缺失是由脫酰胺作用造成的;經(jīng)過糖型分析發(fā)現(xiàn),細胞基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒HA蛋白的糖基化修飾更加復(fù)雜,多天線糖基化修飾所占比例更高,雞胚基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒HA蛋白中糖基修飾比較單一,主要是高甘露糖及去巖藻糖基聚糖。細胞免疫及天然免疫相關(guān)多細胞因子組動物試驗結(jié)果顯示,小鼠在接種細胞基質(zhì)制備的流感疫苗后的6小時內(nèi),血清中MCP-1、IP-10及IL-6濃度顯著升高,說明小鼠的天然免疫反應(yīng)被激活,而雞胚基質(zhì)流感疫苗和去糖基化流感疫苗所引起的細胞因子變化無顯著性差異,說明HA蛋白上的糖基化是誘導(dǎo)天然免疫的因素之一;體液免疫相關(guān)多因子組動物試驗結(jié)果顯示,各組小鼠在接種10天后,血清中的IL-4、IL-5及IL-10濃度無顯著性差異,說明不同基質(zhì)的流感疫苗及去糖基化流感疫苗在誘導(dǎo)體液免疫能力上差異較小;胞內(nèi)細胞因子染色試驗結(jié)果顯示不同疫苗組之間B細胞所占比例無顯著性差異,進一步說明不同基質(zhì)流感疫苗在誘導(dǎo)體液免疫能力上差異不大,而細胞基質(zhì)流感疫苗能更有效的激活CD8+T細胞的分化,且分泌TNF-α、IFN-γ及IL-2的T細胞所占比例顯著高于其雞胚基質(zhì)疫苗和去糖基化流感疫苗組,說明細胞基質(zhì)流感疫苗可誘導(dǎo)更強的細胞免疫反應(yīng),同時也說明糖基化的去除顯著降低了疫苗的免疫原性及免疫效果;在體外中和試驗中,小鼠在接種第二針疫苗后血清中具有中和活性的抗體顯著增加,且細胞基質(zhì)疫苗組小鼠的血清中和效價顯著高于雞胚基質(zhì)疫苗和去糖基化疫苗組,但是在血凝抑制試驗中,發(fā)現(xiàn)雞胚基質(zhì)疫苗組的血清保護能力略高于細胞基質(zhì)流感疫苗組,這兩項試驗結(jié)果的矛盾可能與病毒的培養(yǎng)基質(zhì)有關(guān);在細胞基質(zhì)流感疫苗組中比較了低、較低、中、高四個不同劑量,結(jié)果顯示高劑量組誘導(dǎo)天然免疫、細胞免疫及體液免疫的能力顯著強于中、低劑量組,說明增加劑量對細胞基質(zhì)流感疫苗所產(chǎn)生的免疫保護結(jié)果有顯著影響�！窘Y(jié)論】本課題摸索了一套可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的細胞基質(zhì)流感疫苗純化策略,該方法可有效去除宿主蛋白和DNA,且在不添加廣譜核酸酶的條件下宿主DNA殘留量達到歐洲藥典中核酸殘留質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在HA蛋白生物學(xué)特性的研究中發(fā)現(xiàn)其糖基化位點與糖基化修飾會受到培養(yǎng)基質(zhì)的影響,在細胞基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒中發(fā)現(xiàn)了一個獨特的糖基化位點N292,但是該位點處于HA蛋白莖部不屬于抗原表位區(qū)域,且保守性評分較低,說明并可能未處在受體結(jié)合區(qū)域,所以對于病毒的免疫原性影響仍需進一步確定;同時還發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)培養(yǎng)的H1N1病毒HA上處于受體結(jié)合區(qū)域的幾個糖基化位點的糖基化修飾存在顯著差異,因HA蛋白球狀頭部的糖蛋白在病毒侵染細胞時起關(guān)鍵的識別作用,所以這些位置的糖基化差異有可能導(dǎo)致病毒免疫原性的變化,這說明HA蛋白上的多天線糖基化修飾和更加復(fù)雜的糖基化修飾可能是導(dǎo)致流感病毒免疫原性差異的重要原因。同時本研究還發(fā)現(xiàn)細胞基質(zhì)培養(yǎng)的流感病毒在N103和N303處糖基化缺失是由于脫酰胺作用造成,脫酰胺作用能使蛋白質(zhì)的局部疏水性發(fā)生變化,影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),這與培養(yǎng)基質(zhì)的pH值、離子種類、離子強度密切相關(guān),說明哺乳動物細胞的細胞內(nèi)環(huán)境可能是造成病毒糖蛋白趨向保守的主要原因。在動物試驗中發(fā)現(xiàn)糖基化的存在對于疫苗誘導(dǎo)天然免疫和細胞免疫有顯著影響,說明HA蛋白的糖基化在誘導(dǎo)機體的天然免疫和細胞免疫時起到一定作用,這可能是因為細胞基質(zhì)中流感病毒HA糖基化修飾使得病毒更容易被天然免疫和細胞免疫相關(guān)細胞識別。體液相關(guān)細胞因子的分泌情況與B細胞分化情況說明不同基質(zhì)制備的流感疫苗的誘導(dǎo)體液免疫能力較為一致,但是動物試驗中的體外中和試驗結(jié)果與血凝抑制試驗結(jié)果存在矛盾,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于體外中和試驗中所用的細胞就是培養(yǎng)流感病毒的MDCK細胞,所以小鼠血清中抗體特異性更強,導(dǎo)致血清的中和效價更高,而血凝抑制所用的材料為雞血紅細胞,在結(jié)合雞胚基質(zhì)培養(yǎng)的流感病毒時能力更強,導(dǎo)致血凝實驗中雞胚基質(zhì)疫苗組結(jié)果更好,同時上述兩項試驗結(jié)果也說明在檢定兩種基質(zhì)流感疫苗時應(yīng)區(qū)分別建立特異性檢定方法才能獲得更準(zhǔn)確的檢定結(jié)果。
【學(xué)位單位】：武漢生物制品研究所
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R392-33
【部分圖文】：

武漢生物制品研究所2020屆博士研究生畢業(yè)論文4三個主要部分組成。包膜蛋白由三種跨膜蛋白修飾：HA、NA和基質(zhì)蛋白2（MatrixProtein2,M2），其中HA和NA均為囊膜糖蛋白，是體液免疫反應(yīng)所針對的關(guān)鍵抗原，M2蛋白則起到離子通道作用，在病毒包膜外的HA和NA具有頂端分選信號[4]，并利離子通道進行細胞表面運輸和頂端分選，HA蛋白作為流感病毒上一種極為重要的包膜蛋白，是一種突出于病毒表面的蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)病毒與宿主細胞的附著、病毒的內(nèi)化以及病毒衣殼與細胞核內(nèi)體膜的融合[5]，HA蛋白的結(jié)構(gòu)可分為球狀頭部（HA1）和跨膜的莖部（HA2），即使在同一亞型中流感病毒的HA1部分也會產(chǎn)生較大變異，莖部則相對保守；基質(zhì)蛋白則處于中間層，主要是基質(zhì)蛋白1（MatrixProtein1,M1）構(gòu)建起整個病毒的骨架；核心由聚合酶堿性蛋白1和2（PolymeraseBasicProtein1，PB1;PolymeraseBasicProtein2,PB2）、核蛋白（Nucleoprotein）和負(fù)鏈病毒RNA組成最內(nèi)層螺旋狀病毒核糖核衣殼蛋白（vRNP）。除此之外，病毒顆粒中還含有非結(jié)構(gòu)蛋白2（NonstructuralProtein2，NS2）等蛋白。病毒的結(jié)構(gòu)如圖1所示。圖1.1流感病毒結(jié)構(gòu)示意圖Fig1.1Influenzavirusstructure流感疫苗的變異主要由抗原漂移（AntigenicDrift）及抗原轉(zhuǎn)換（AntigenicShift）引起�？乖剖侵覆《竞塑账嵛稽c的突變而導(dǎo)致的氨基酸的改變，某些關(guān)鍵位點的氨基酸變化則會導(dǎo)致病毒的抗原性發(fā)生變化。這是因為流感病毒屬于RNA病毒，而RNA病毒的聚合酶的校正閱讀能力是缺失的，所以在病毒復(fù)制過

武漢生物制品研究所2020屆博士研究生畢業(yè)論文7圖1.2中國2017.06至2019.09流感發(fā)病人數(shù)統(tǒng)計圖Fig1.2NumberofinfluenzacasesinChinafromJune2017toSeptember2019大規(guī)模的流感流行均是由甲型流感病毒引起的，季節(jié)性流感則主要由甲型和乙型兩種病毒引起。根據(jù)2017年美國監(jiān)測機構(gòu)對于美國31個流感流行季的統(tǒng)計，H3N2主導(dǎo)了其中22個，而這期間流感的致病率和致死率是非H3N2流行季的2.7倍[27]。相比甲型，乙型的流感病毒更加穩(wěn)定，乙型Yamagata株和乙型Victoria株已經(jīng)流行40余年，還保持著流行株的主導(dǎo)位置[28]。流感與普通感冒在癥狀上類似，都伴隨著乏力、頭疼、咳嗽甚至高熱等，但是普通感冒引發(fā)的癥狀在幾天后會開始減輕，而流感則容易變得嚴(yán)重。嚴(yán)重的流感會引起：病毒型肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、休克、哮喘、充血性心力衰竭、繼發(fā)細菌性肺炎、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等多種并發(fā)癥，最嚴(yán)重的會導(dǎo)致死亡[29,30]。抵抗力較差的人群，如老年人、兒童或有較嚴(yán)重病灶的患者，在感染流感病毒后容易發(fā)展為重癥。雖然上述人群更易感染流感，但是流感仍可以影響各個年齡層，因為醫(yī)療資源使用的增加和損失的生產(chǎn)力，每年的流感都會導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會經(jīng)濟問題[31]，特別是在低收入國家和中等收入國家[32]。

武漢生物制品研究所2020屆博士研究生畢業(yè)論文9圖1.3流感病毒與對應(yīng)疫苗發(fā)展歷程Fig1.3Developmentofinfluenzavirusandcorrespondingvaccine1.3.1早期的流感疫苗1936年蘇聯(lián)的Smorodintseff將流感病毒在雞胚中傳代30次，發(fā)現(xiàn)這種多次傳代的病毒對于實驗者只會引起輕微的發(fā)熱，因此這種方法被用來制備流感減毒活疫苗，并廣泛使用在工人中[39]。同時代其他國家的資料顯示流感減毒活疫苗在傳代至足夠安全時，對于沒有天然免疫的青壯年有著較好的保護力，但是對于兒童和老人疫苗能提供的保護則很有限[40-42]。但是受制于當(dāng)時的技術(shù)條件，流感減毒活疫苗仍存在隱患，如減毒株的穩(wěn)定性、減毒株與野毒株重組的風(fēng)險等。目前減毒活疫苗在美國等國家仍在使用，但是僅被用于免疫力較強的2~7歲兒童。美國和英國在二戰(zhàn)期間開始研發(fā)流感滅活疫苗，主要是為軍隊提供保障[43]。在雞胚尿囊液中培養(yǎng)流感病毒是一種相對簡單的方法，澳大利亞的Burnet等人以此為基礎(chǔ)開始制備流感疫苗[44]。美國的ThomasFrancis利用純化手段在雞胚尿囊液中獲得了高濃度的病毒液，并用福爾馬林進行滅活，從而制備了流感滅活疫苗[45]。同時使用的H1N1（PR8）株因為在尿囊液中復(fù)制能力比減毒株強，病毒的收獲量也隨之增大，極大地增加了疫苗的產(chǎn)量。早期流感病毒疫苗均為全病毒疫苗，副反應(yīng)嚴(yán)重，1968年巴斯德公司首次使用裂解的方式制備流感疫苗，裂解后除去病毒核酸和不需要的大分子蛋白，僅保留抗原性較強的HA,NA,M及NP蛋白，這使接種后的不良反應(yīng)大大減少。1976年亞單位疫苗成功被研發(fā)，該技術(shù)生產(chǎn)的流感疫苗僅含有HA和NA蛋白，有效抗原含量進一步提升。1.3.2雞胚基質(zhì)流感疫苗雞胚基質(zhì)流感疫苗是自流感疫苗誕生以來一直使用的方法，1944年Stanley等人撰寫了雞胚基質(zhì)流?
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 曾祥興;李康生;;流感百年:20世紀(jì)流感大流行的回顧與啟示[J];醫(yī)學(xué)與社會;2010年11期

2 阿麗塔;許培揚;田玲;張玢;劉曉婷;;基于文獻的1918年西班牙流感中國疫情分析[J];醫(yī)學(xué)信息學(xué)雜志;2010年01期

3 萬彬;陳萍;付莉;張志力;羅東霞;曹燕;;甲型H1N1流感患者的護理[J];中華護理雜志;2009年11期

4 流感研究上海協(xié)作組;吳迪;徐天磊;孫靜;戴建新;丁國徽;何云剛;周正峰;熊慧;董輝;金維榮;邊超;金力;王紅艷;王小寧;楊忠;鐘揚;王皓;車小燕;黃忠;藍柯;孫兵;吳凡;袁政安;張曦;周曉農(nóng);周佳海;馬志永;童光志;郭亞軍;趙國屏;李亦學(xué);曹志偉;;甲型H1N1流感病毒HA蛋白結(jié)構(gòu)模建與構(gòu)象表位分析[J];科學(xué)通報;2009年12期

5 任麗偉;陳強;徐貴江;李碧春;;禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶的研究進展[J];廣東畜牧獸醫(yī)科技;2009年02期

6 余元勛;;病毒包膜糖蛋白[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);1983年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 平繼輝;H9N2亞型禽流感病毒抗原變異及感染哺乳動物分子機制的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 古小兵;華東地區(qū)2011-2012禽流感流行病學(xué)調(diào)查及近三年H9N2禽流感病毒遺傳進化分析[D];揚州大學(xué);2013年

2 解茹;聚乙二醇修飾對蛋白質(zhì)的脫酰胺與二硫鍵的影響研究[D];北京化工大學(xué);2010年

本文編號：2870185