目的:本文旨在通過兩步離心法提取新西蘭大白兔自體富血小板血漿,并研究富血小板血漿分泌的外泌體,對富血小板血漿來源外泌體進(jìn)行分析鑒定;進(jìn)一步探究富血小板血漿來源外泌體對體外骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖凋亡影響以及與其相關(guān)的信號通路;觀察富血小板血漿來源外泌體對動物模型中骨關(guān)節(jié)炎的治療效果,為骨關(guān)節(jié)炎的早期治療尋找有效的治療手段,為富血小板血漿來源外泌體的臨床成果轉(zhuǎn)化提供堅(jiān)定的理論支持及循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。方法:第一部分:抽取新西蘭大白兔耳緣靜脈血液,通過兩步離心法提取自體富血小板血漿,然后利用外泌體提取試劑盒(exoEasy Maxi Kit)提取富血小板血漿來源外泌體(PRP-exos);利用透射電鏡對富血小板血漿來源外泌體進(jìn)行動態(tài)觀察,利用納米跟蹤分析技術(shù)(NTA)分析其大小與濃度,采用免疫蛋白印跡(Westemblotting)明確富血小板血漿來源外泌體上的標(biāo)志性蛋白分子;將提取的外泌體置于-80°液氮保存,備用。第二部分:剝離新西蘭大白兔雙膝軟骨層,用膠原酶處理后分離和提取原代軟骨細(xì)胞,經(jīng)阿利新藍(lán)、番紅固綠及免疫組織化學(xué)(COL Ⅱ)染色鑒定;進(jìn)一步傳代培養(yǎng)后用于其他實(shí)驗(yàn)(三代內(nèi))。于P1代軟骨細(xì)胞加入IL-1β(10ng/ml)模擬骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞模型,并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定軟骨細(xì)胞釋放的炎性因子TNF-α。按照如下分組進(jìn)行試驗(yàn):①對照組(Control組),②IL-1β組,③IL-1 β+PRP-as(5ug/ml)組,④IL-1 β+PRP-as(50ug/ml)組,⑤IL-1 β+PRP-exos(5ug/ml)組,⑥IL-1β+PRP-exos(50ug/ml)組。通過流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞增殖實(shí)試驗(yàn)(CCK-8)、遷移試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)來比較PRP-exos與激活的富血小板血漿(PRP-as)對骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞的影響,從而比較PRP-exos與PRP-as對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的作用差異。通過Western Blotting測定骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨細(xì)胞經(jīng)PRP-exos或PRP-as共培養(yǎng)后β-catenin、RUNX2和Wnt5a的表達(dá),探究PRP-exos對骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨細(xì)胞作用的信號通路。第三部分:取24只清潔級新西蘭大白兔,采用隨機(jī)分組對照原則,分為空白對照組(Sham group)、模型組(Model group)和實(shí)驗(yàn)組,其中實(shí)驗(yàn)組又分為:①PRP-exos組(100ug/ml)、②PRP-as組(100ug/ml),每組6只(n=6)�？瞻讓φ战M僅切開左膝關(guān)節(jié)囊,不做其他任何關(guān)節(jié)內(nèi)處理,然后予以縫合;模型組和實(shí)驗(yàn)組則行改良Hulth法制作左膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型(將內(nèi)側(cè)半月板切除,將內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶切斷)。建模后7天內(nèi)連續(xù)肌肉注射青霉素80萬單位,每天一次,預(yù)防刀口感染。建模6周后將實(shí)驗(yàn)各組動物于耳緣靜脈抽取自體靜脈血1Oml,按照第一部分方法制備富血小板血漿及富血小板血漿來源外泌體,并進(jìn)行蛋白濃度測定;然后按照實(shí)驗(yàn)組各組濃度要求行左膝關(guān)節(jié)腔注射;空白對照組與模型組關(guān)節(jié)腔內(nèi)按相同方法注射等量生理鹽水(0.6ml)。每周注射1次,連續(xù)注射6周后將各組動物處死。通過大體形態(tài)學(xué)觀察、蘇木素伊紅染色(HE染色)、免疫組織化學(xué)染色(COL-2、RUNX2)、OARSI評分等方法比較PRP-exos與PRP-as在體內(nèi)治療骨關(guān)節(jié)炎的效果,觀察有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:第一部分:本論文通過兩部離心法成功從新西蘭大白兔血漿提取出富血小板血漿,并進(jìn)一步用外泌體提取試劑盒(exoEasy Maxi Kit)從中提取出富血小板血漿來源外泌體,并用透射電子顯微鏡(TEM)觀察到PRP-exos是一種圓形或橢圓形的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的小囊泡;通過粒徑分析儀,測出其直徑范圍為145.6±50.4 nm;采用蛋白免疫印跡(WB)可測定出PRP-exos的表面有CD9、CD63、CD81和HSP101的表達(dá),其均為外泌體的特異性標(biāo)志分子,更進(jìn)一步證明富血小板血漿中外泌體的存在。第二部分:本研究成功提取出軟骨細(xì)胞,并進(jìn)行了傳代培養(yǎng)。軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為三角形、多邊形或紡錘形,該細(xì)胞的蛋白多糖沉積可被阿爾新藍(lán)染成藍(lán)色,而經(jīng)番紅固綠染色可見細(xì)胞基質(zhì)為深紅色,進(jìn)一步對該細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(COL-II),表現(xiàn)為細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕褐色,這些染色結(jié)果均可有效證明提取的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。在體外試驗(yàn)中,本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β(10ng/ml)可成功誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性改變,明顯增加TNF-α的釋放,采用ELISA測定IL-1β組TNF-α的OD值為2.58±0.11,與對照組相比明顯增加(P0.05)。在加入不同濃度PRP-exos及PRP-as后,測定各組TNF-α的OD值(PRP-exos 5ug/ml:2.16±0.08;PRP-exos 50ug/ml:2.05±0.13;PRP-as 5ug/ml:2.25±0.06;PRP-as50ug/ml:2.08±0.04;P0.05)均明顯下降,而各濃度組之間相比,無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)中,用IL-1β(10ng/ml)模擬骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞,在加入不同濃度的PRP-exos和PRP-as(5ug/ml、50ug/ml)后,經(jīng)CCK8試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組在培養(yǎng)24h、48h、72h、120h后軟骨細(xì)胞均較誘導(dǎo)組明顯增殖(P0.05);且高濃度組在各個(gè)時(shí)間段均是PRP-exos組優(yōu)于PRP-as組(P0.05),而低濃度組在培后24h、48h時(shí)PRP-exos組優(yōu)于PRP-as組(P0.05),在培養(yǎng)72h、120h后兩者無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。通過細(xì)胞凋亡研究(流式細(xì)胞術(shù)),我們發(fā)現(xiàn)高濃度的PRP-exos及PRP-as均顯著抑制經(jīng)IL-1β(10ng/ml)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡(PRP-exos 50ug/ml:10.45±0.36;PRP-as50ug/ml:12.34±0.42;誘導(dǎo)組13.85±0.34,P0.05),且PRP-exos的作用效果明顯好于PRP-as,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。但是,在低濃度組,兩者對誘導(dǎo)組軟骨細(xì)胞凋亡的抑制效果差別不顯著,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在體外細(xì)胞遷移試驗(yàn)中,我們研究發(fā)現(xiàn)IL-1β(10ng/ml)顯著地抑制軟骨細(xì)胞的遷移;而PRP-exos與PRP-as均可明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移,且在相同濃度時(shí)前者的作用效果大于后者,同時(shí)高濃度的PRP-exos及PRP-as的作用效果均大于低濃度組。通過細(xì)胞劃痕試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)在連續(xù)培養(yǎng)6h、12h后僅有高濃度PRP-exos可促進(jìn)軟骨細(xì)胞明顯遷移(P0.05),而其他各組對軟骨細(xì)胞的遷移作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在用Western blotting進(jìn)行的相關(guān)信號通路研究中,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞可使Wnt/β-catenin信號通路中的β-catenin、RUNX2和Wnt5a均高表達(dá),而加入PRP-exos和PRP-as后可使其降低表達(dá),具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中對RUNX2和Wnt5a表達(dá)的降低作用PRP-exos要大于PRP-as(P0.05),而對β-catenin表達(dá)的降低作用PRP-exos要小于PRP-as(P0.05)。第三部分:本次動物實(shí)驗(yàn)研究中無意外死亡發(fā)生。根據(jù)改良Hulth法成功制作出新西蘭大白兔左膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型,并進(jìn)行隨機(jī)對照分組實(shí)驗(yàn)。建模6周后將實(shí)驗(yàn)動物利用空氣栓塞法處死,獲取標(biāo)本,經(jīng)大體形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn),模型組即OA組膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)滑膜組織水腫,股骨內(nèi)髁軟骨呈暗灰色,觸摸表面不平整,股骨內(nèi)髁可見部分軟骨變薄,周圍多發(fā)骨贅形成,而PRP-exos組和PRP-as組骨關(guān)節(jié)炎改變均較模型組輕。通過HE染色發(fā)現(xiàn)模型組軟骨表面局灶性增生,軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則,邊界模糊,而PRP-exos及PRP-as組則均有明顯改善,關(guān)節(jié)軟骨表面尚完整,顏色較OA組正常,無關(guān)節(jié)軟骨面缺損;進(jìn)一步通過軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),PRP-exos組與PRP-as組均可顯著使軟骨細(xì)胞增加(P0.05),而且PRP-exos的作用要大于PRP-as組(P0.05)。通過對標(biāo)本進(jìn)行COL Ⅱ和RUNX2免疫組織化學(xué)染色,我們發(fā)現(xiàn)PRP-exos和PRP-as均可逆轉(zhuǎn)骨關(guān)節(jié)炎引起的Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)減少并抑制RUNX2蛋白的表達(dá),促進(jìn)軟骨修復(fù),并且前者的作用大于后者(P0.05)。根據(jù)OARSI推薦的評分顯示,OA組的評分較對照組明顯升高(P0.05),而PRP-exos組的評分及PRP-as的評分較OA組降低,說明PRP-exos及PRP-as均可有效抑制骨關(guān)節(jié)炎(P0.05);且PRP-exos的評分低于PRP-as,表明PRP-exos抑制骨關(guān)節(jié)炎的作用大于PRP-as(P0.05)。結(jié)論:本研究成功地從新西蘭大白兔血液中提取富血小板血漿,并從中提取和鑒定分析了富血小板血漿來源的外泌體。本研究成功提取了兔軟骨細(xì)胞,并于體外經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)成功建立了體外骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞模型。通過研究發(fā)現(xiàn)富血小板血漿來源外泌體可以促進(jìn)經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖和遷移,抑制軟骨細(xì)胞凋亡。PRP-exos通過Wnt/β-catenin信號通路中的相關(guān)蛋白表達(dá)及負(fù)表達(dá),從而達(dá)到抑制骨關(guān)節(jié)炎的效果。由于PRP-exos在緩解骨關(guān)節(jié)炎方面的作用大部分明顯優(yōu)于PRP-as,或有部分與其相似,因此我們認(rèn)為富血小板血漿來源外泌體可能在關(guān)節(jié)腔注射富血小板血漿治療骨關(guān)節(jié)炎方面起主導(dǎo)作用。綜上所述,我們認(rèn)為富血小板血漿來源的外泌體(PRP-exos)具有潛在的治療骨關(guān)節(jié)炎的作用,通過關(guān)節(jié)腔注射PRP-exos可以作為治療骨關(guān)節(jié)炎的新手段,為今后骨關(guān)節(jié)炎臨床治療的探索和應(yīng)用提供一種新的途徑。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R684.3
【部分圖文】：

圖３ｂ??２１??

源外泌體，其所測得直徑約為１４５．６±５０．４ｎｍ，顆粒濃度約為４．６７土０．２１＊１０八６??ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ?（如圖?３ｂ?戶亓示）。??４．ＰＲＰ－ｅｘｏｓ的表面特異性標(biāo)志物表達(dá)結(jié)果??為了研宄ＰＲＰ－ｅｘｏｓ的生物學(xué)特性，我們將提取的ＰＲＰ－ｅｘｏｓ進(jìn)行了蛋白免疫??印跡（Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）檢測，來尋找提取物表面的標(biāo)志性蛋白。結(jié)果顯示：夕卜??泌體的特異性標(biāo)志性蛋白ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＨＳＰ１０１均在ＰＲＰ－ｅｘｏｓ上特異性??表達(dá)，這充分說明我們從ＰＲＰ中提取的液體是富血小板血漿來源的外泌體。這??也為我們后續(xù)試驗(yàn)研究成功奠定了基礎(chǔ)。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果如下圖４所示。??

?山東大學(xué)博士學(xué)位論文???????附錄??」??ｆｉｋ??圖１：?Ａ處死新西蘭大白兔后消毒雙側(cè)膝關(guān)節(jié)；Ｂ剝離包裹軟骨組織的筋膜和軟??骨膜，放入盛有ＰＢＳ液的培養(yǎng)皿中；Ｃ將所得軟骨組織修剪，切成約０．３－０．５ｍｍ。??＿縱ｊ??，＃?？？?？？？？?？＊?．?？?？?－?＊?ｉ?／？?＊，Ｕｆ?■，??．？？？?ｖ．．，＊１＾ｆ??＇，．，？？?＇．之？：＇？?＇，＜?＾?－，丄．??Ｃ?Ｄ??圖２：?Ａ提取的原代軟骨細(xì)胞（２０〇ｘ）?；?Ｂ軟骨細(xì)胞經(jīng)阿利新藍(lán)染色結(jié)果（４０〇ｘ）；??Ｃ軟骨細(xì)胞經(jīng)番紅固綠染色結(jié)果（４００＞０?；?Ｄ軟骨細(xì)胞經(jīng)ＣＯＬ?ＩＩ免疫組織化學(xué)??染色結(jié)果（４０〇ｘ）。??４８??
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本文編號：2868503