結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)作為消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,全球每年新發(fā)病例超過120萬,并且每年約有60萬人死于CRC。手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤是治療結(jié)直腸癌的首選方式,但手術(shù)后因感染誘發(fā)的炎癥反應(yīng)及腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC患者預(yù)后較差的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多基因參與的過程,包括細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附降低、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力增強(qiáng)、基質(zhì)金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)等。其中,細(xì)胞遷移和粘附是腫瘤遷移能力的重要指標(biāo)。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作為革蘭氏陰性菌外膜上的一種糖蛋白,可引起全身炎癥反應(yīng)和嚴(yán)重?cái)⊙Y,與CRC術(shù)后腹內(nèi)感染并發(fā)癥有關(guān)。結(jié)直腸癌患者手術(shù)后,LPS含量會(huì)明顯上升并引起炎癥反應(yīng)。然而LPS在CRC進(jìn)程中的明確作用目前仍不清楚。因此,研究CRC粘附、轉(zhuǎn)移及炎癥微環(huán)境改變誘導(dǎo)CRC惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理,對(duì)減少CRC患者的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。無論氧氣存在與否,腫瘤細(xì)胞主要依賴糖酵解而不是氧化磷酸化進(jìn)行葡萄糖代謝,這一糖代謝異�，F(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)。目前認(rèn)為,M2型丙酮酸激酶在Warburg效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)作為糖酵解途徑的限速酶,能夠?qū)⒘姿嵯┐际奖徂D(zhuǎn)變成丙酮酸。PKM1和PKM2作為PK最為常見的兩個(gè)亞型,由PKM基因經(jīng)選擇性剪接產(chǎn)生。PKM1蛋白主要在除了肝、腎和血紅細(xì)胞之外的正常細(xì)胞中高表達(dá),而PKM2蛋白則在干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。PKM1具有穩(wěn)定的四聚體結(jié)構(gòu),不受別構(gòu)調(diào)節(jié)。PKM2受到別構(gòu)調(diào)控,并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生二聚體和四聚體間轉(zhuǎn)化。PKM2四聚體具有較高的丙酮酸激酶活性,而二聚體形式則具有蛋白激酶活性,兩種活性的轉(zhuǎn)換為腫瘤細(xì)胞提供生長優(yōu)勢和對(duì)微環(huán)境的適應(yīng)能力。已有報(bào)道顯示,PKM2在腫瘤細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化、血管生成和細(xì)胞周期進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。然而,PKM1和PKM2在結(jié)腸癌細(xì)胞粘附、轉(zhuǎn)移及炎癥微環(huán)境的作用仍不明確。本文通過構(gòu)建穩(wěn)定敲低PKM的DLD1細(xì)胞株以及穩(wěn)定過表達(dá)PKM1、PKM2及PKM2不同活性突變體的DLD1細(xì)胞株,分別探討了PKM1與PKM2在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移與粘附、炎癥因子分泌與增殖調(diào)控中的作用與機(jī)制；通過原核表達(dá)GST-PKM1、 GST-PKM2融合蛋白來模擬分泌型PKM1和PKM2,檢測其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響并探討其作用機(jī)制。獲得以下研究結(jié)果：1.通過構(gòu)建敲低PKM、過表達(dá)PKM1、PKM2以及過表達(dá)PKM2的K367M、R399E和K433E等突變體的慢病毒表達(dá)載體。采用慢病毒包裝、收獲、轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞,經(jīng)puromycin篩選、qPCR和western blot技術(shù)檢測,得到穩(wěn)定細(xì)胞株。2.通過細(xì)胞劃痕法和細(xì)胞基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PKM2,而不是PKM1,能夠明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及粘附。qPCR和western blot結(jié)果顯示,過表達(dá)PKM2能明顯提高N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Snail-2的表達(dá),促進(jìn)FAK的磷酸化以及β1-integrin的活化,并抑制E-cadherin的表達(dá)。敲低PKM能明顯逆轉(zhuǎn)PKM2誘導(dǎo)的遷移粘附相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)。特別是過表達(dá)PKM2能夠上調(diào)STAT3的mRNA水平、蛋白水平、磷酸化水平以及STAT3的核轉(zhuǎn)位。放線菌素D實(shí)驗(yàn)顯示,PKM2上調(diào)STAT3的表達(dá)主要是通過調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平,而不是通過抑制mRNA降解。在過表達(dá)PKM2的細(xì)胞株中瞬時(shí)敲低STAT3的表達(dá),結(jié)果表明,敲低STAT3能夠有效逆轉(zhuǎn)PKM2誘導(dǎo)的遷移粘附相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)及細(xì)胞遷移。通過檢測PKM2不同活性點(diǎn)突變的穩(wěn)定細(xì)胞株中丙酮酸激酶活性、STAT3的表達(dá)和磷酸化水平以及細(xì)胞遷移能力,發(fā)現(xiàn)DLD1-R399E細(xì)胞缺乏丙酮酸激酶活性,能明顯增加STAT3和磷酸化STAT3的表達(dá),促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移。3.LPS可以明顯促進(jìn)DLD1細(xì)胞中PKM2、TNF-α、IL-1β的表達(dá),并具有濃度依賴性,而PKM1的表達(dá)不受LPS影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LPS可以促進(jìn)DLD1細(xì)胞增殖。Western blot、qPCR、ELISA以及MTT結(jié)果顯示,敲低PKM能夠抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β的表達(dá)、分泌以及結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。過表達(dá)PKM2可以明顯促進(jìn)TNF-αIL-1β的表達(dá)以及LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。NF-κB的抑制劑BAY-11-7082能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB亞基p65、PKM2的表達(dá)。敲低PKM能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的STAT3的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位,而對(duì)LPS誘導(dǎo)的p65的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位無影響。在過表達(dá)PKM2細(xì)胞中瞬時(shí)敲低STAT3,可以逆轉(zhuǎn)由PKM2引起的TNF-a和IL-1β的表達(dá)。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示,LPS能促進(jìn)PKM2與STAT3啟動(dòng)子的結(jié)合,通過促進(jìn)STAT3的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控TNF-α、IL-1β的表達(dá)。DLD1-R399E細(xì)胞能明顯促進(jìn)STAT3的表達(dá)和]TNF-α、IL-1β的分泌。4.通過原核表達(dá)純化GST-PKM1、GST-PKM2處理DLD1細(xì)胞模擬分泌型PKM1、PKM2的功能,發(fā)現(xiàn)分泌型PKM2能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移。敲低PKM2能明顯減少PKM2的分泌及由分泌型PKM2誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移。分泌型PKM2能促進(jìn)MMP-2、MMP-9、N-cadherin、β、catenin勺表達(dá),抑制E-cadherin的表達(dá)。分泌型PKM2能夠促進(jìn)Akt的磷酸化,而PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002能抑制分泌型PKM2誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及E-cadherin、N-cadherin和β-catenin的表達(dá)。采用siRNA干擾β-catenin表達(dá),可以明顯逆轉(zhuǎn)分泌型PKM2誘導(dǎo)的E-cadherin、 N-cadherin的表達(dá)。綜上所述：PKM2依賴其蛋白激酶活性而不是丙酮酸激酶活性,調(diào)控STAT3轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和粘附。LPS通過誘導(dǎo)PKM2表達(dá)、增強(qiáng)PKM2與STAT3基因啟動(dòng)子結(jié)合、加強(qiáng)STAT3的表達(dá)與核轉(zhuǎn)位,調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞TNF-a和IL-1p的表達(dá)與分泌。分泌型PKM2能通過PI3K/Akt和β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移。因此,PKM2在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、粘附、炎癥因子的分泌調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,可作為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和術(shù)后炎癥反應(yīng)診治的靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R735.35
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 Warburg效應(yīng)與PKM2
    2 PKM2概述
        2.1 PKM2的表達(dá)調(diào)控
            2.1.1 PKM的表達(dá)調(diào)節(jié)
            2.1.2 PKM基因的選擇性剪接
            2.1.3 表觀遺傳及microRNA調(diào)控
            2.1.4 PKM2蛋白穩(wěn)定性調(diào)控
        2.2 PKM2的活性調(diào)控
            2.2.1 代謝中間產(chǎn)物對(duì)PKM2的活性調(diào)控
            2.2.2 翻譯后修飾對(duì)PKM2的活性調(diào)控
        2.3 PKM2對(duì)腫瘤代謝的調(diào)控
        2.4 PKM2對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控
        2.5 PKM2的臨床應(yīng)用
    3 本課題的研究意義及研究內(nèi)容
第二章 PKM1和PKM2不同活性突變體的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒
            2.1.2 試劑與抗體
            2.1.3 主要試劑配制方法
            2.1.4 主要儀器設(shè)備
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
            2.2.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄cDNA
            2.2.4 PKM1、PKM2慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.5 PKM2不同點(diǎn)突變慢病毒載體K367M、R399E和K433E的構(gòu)建
            2.2.6 穩(wěn)定敲低PKM慢病毒載體的構(gòu)建
            2.2.7 慢病毒包裝
            2.2.8 DLD1細(xì)胞株轉(zhuǎn)染和篩選
            2.2.9 熒光定量PCR和western blot鑒定穩(wěn)定細(xì)胞株
    3 結(jié)果
        3.1 穩(wěn)定敲低PKM的結(jié)腸癌細(xì)胞株的獲得及檢測
        3.2 穩(wěn)定過表達(dá)PKM1、PKM2的結(jié)腸癌細(xì)胞株的獲得及檢測
        3.3 PKM2不同活性突變體的穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株的獲得及檢測
    4 討論
第三章 PKM2過表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞遷移與粘附的分子機(jī)制
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒
            2.1.2 試劑與抗體
            2.1.3 主要試劑配制方法
            2.1.4 主要儀器設(shè)備
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR分析
            2.2.3 細(xì)胞漿蛋白、核蛋白抽提和western blot分析
            2.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
            2.2.5 細(xì)胞基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)
            2.2.6 siRNA轉(zhuǎn)染敲低STAT3
            2.2.7 丙酮酸激酶活性分析
            2.2.8 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 敲低PKM抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移
        3.2 敲低PKM抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞與基質(zhì)的粘附作用
        3.3 敲低PKM引起結(jié)腸癌細(xì)胞遷移與粘附變化的分子機(jī)制
        3.4 過表達(dá)PKM2能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和粘附
        3.5 過表達(dá)PKM2逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、粘附相關(guān)的信號(hào)
        3.6 PKM2調(diào)控STAT3表達(dá)的機(jī)制
        3.7 PKM2通過調(diào)控STAT3表達(dá)來促進(jìn)DLD1細(xì)胞遷移和細(xì)胞基質(zhì)粘附
        3.8 PKM2促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和粘附依賴其蛋白激酶活性
    4 討論
第四章 PKM2促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞炎癥因子分泌及增殖的分子機(jī)制
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 細(xì)胞
            2.1.2 試劑與抗體
            2.1.3 主要試劑配制方法
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 細(xì)胞漿蛋白、核蛋白抽提和western blot分析
            2.2.3 MTT法檢測LPS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響
            2.2.4 qPCR分析
            2.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測TNF-α與IL-1β的分泌
            2.2.6 siRNA轉(zhuǎn)染敲低STAT3
            2.2.7 免疫質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）分析
            2.2.8 丙酮酸激酶活性分析
            2.2.9 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 LPS促進(jìn)DLD1細(xì)胞TNF-α與IL-1β的表達(dá)與細(xì)胞增殖
        3.2 LPS誘導(dǎo)DLD1細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)和代謝改變
        3.3 敲低PKM能逆轉(zhuǎn)LPS引起的結(jié)腸癌細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)與增殖
        3.4 PKM2過表達(dá)促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的DLD1細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)與增殖
        3.5 NF-κB信號(hào)調(diào)控LPS誘導(dǎo)的PKM2的表達(dá)
        3.6 PKM2通過上調(diào)STAT3表達(dá)來調(diào)控TNF-α和IL-1β的表達(dá)
        3.7 ChIP檢測PKM2結(jié)合STAT3啟動(dòng)子
        3.8 LPS同時(shí)誘導(dǎo)了胞內(nèi)PKM2的丙酮酸激酶及蛋白激酶活性
        3.9 PKM2誘導(dǎo)的炎癥因子分泌依賴其蛋白激酶活性
    4 討論
第五章 分泌型PKM2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響及分子機(jī)制
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒
            2.1.2 試劑與抗體
            2.1.3 主要試劑配制方法
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的收集
            2.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-PKM1和pGEX-4T-1-PKM2的構(gòu)建
            2.2.3 重組蛋白GST-PKM1、GST-PKM2的表達(dá)與純化
            2.2.4 細(xì)胞劃痕法檢測細(xì)胞遷移
            2.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測mRNA變化
            2.2.6 Western blot檢測蛋白變化
            2.2.7 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染敲低β-catenin、PKM2
            2.2.8 PI3K信號(hào)通路抑制劑LY294002對(duì)細(xì)胞遷移的影響
            2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 結(jié)腸癌細(xì)胞系中分泌型PKM1、PKM2的檢測
        3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-PKM1和pGEX-4T-1-PKM2的構(gòu)建
        3.3 重組蛋白GST-PKM1、GST-PKM2的表達(dá)與純化
        3.4 分泌型PKM2促進(jìn)結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞遷移
        3.5 敲低PKM2抑制PKM2的分泌及DLD1細(xì)胞的遷移
        3.6 分泌型PKM2活化p-catenin信號(hào)通路
        3.7 分泌型PKM2激活PI3K/Akt促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移
    4 討論
總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡歷及讀博期間發(fā)表文章
致謝
承諾書


本文編號(hào)：2867949