本文關鍵詞：MCLR與TiO_2NPs肝細胞暴露的炎癥信號響應，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：針對環(huán)境微污染人體健康的毒性預警問題,面對中國南方水體微囊藻毒素污染誘導的化學性損傷和局部水源中納米材料污染帶來的物理性損傷,本研究選取典型微囊藻毒素(MCLR)和兩種納米二氧化鈦(TiO2NPs)材料(銳鈦礦和金紅石),采用體外原代與離體肝細胞系實驗模型,突破肝細胞敏感炎癥信號轉(zhuǎn)導及免疫風險表達技術,解析細胞亞顯微結(jié)構(gòu)應激損傷及信號轉(zhuǎn)導失調(diào)潛在機制,揭示炎癥信號通路MAPK和NF-κB對MCLR與TiO2NPs單一及復合暴露響應的劑量效應規(guī)律,提供環(huán)境微污染早期肝炎風險敏感預警方法。主要研究結(jié)果如下：(1)MAPK和NF-κB炎癥信號通路被MCLR磷酸化激活介導其肝炎風險1-1000μg/L MCLR暴露24h后,引起原代小鼠肝細胞(PMHs)活力顯著下降p0.05),其蛋白降解EC50值為11.86±1.01-14.49±3.74μg/L；而在人肝細胞系(HepG2)內(nèi)未引起顯著細胞毒性,表明原代肝細胞PMHs對MCLR響應較HepG2更為敏感。運用免疫印跡和熒光素酶報告系統(tǒng)測定炎癥信號通路MAPK和NF-κB激活結(jié)果表明亞細胞致死劑量MCLR引起PMHs(25μg/L)和HepG2(1000μg/L)細胞內(nèi)MAPK和NF-κB顯著磷酸化激活(p0.05)。MAPK和NF-κB通路激活介導下游炎性因子IL-6蛋白表達上調(diào),證實MCLR對肝細胞的促炎作用。MAPK和NF-κB對MCLR和炎性因子TNFa復合暴露的激活響應表明MCLR預暴露使肝細胞呈高敏狀態(tài)促進TNFa誘導的MAPK和NF-κB通路激活及IL-6表達,有效指示炎癥敏感人群MCLR二次暴露風險。TEM亞顯微結(jié)構(gòu)觀察進一步指出PMHs內(nèi)線粒體對MCLR暴露最為敏感,在大于25μg/L劑量下其雙層膜破裂,內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)和基質(zhì)流失,表明線粒體結(jié)構(gòu)損傷可能介導MAPK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導失調(diào)。(2) MAPK和NF-κB通路對TiO2NPs差異性動態(tài)響應受其團聚形態(tài)調(diào)控TiO2NPs在高于160μg/mL劑量下致肝細胞HepG2顯著死亡(p0.05),金紅石細胞毒性強于銳鈦礦。在亞細胞致死劑量5-160μg/mL TiO2NPs暴露下,HepG2內(nèi)MAPK通路中的ERK1/2、p38及NF-κB通路中的IκBα磷酸化表達顯著上調(diào)p0.05),與暴露劑量呈正相關。兩種TiO2NPs誘導MAPK和NF-κB動態(tài)激活規(guī)律在24h暴露內(nèi)存在差異,金紅石與銳鈦礦對p38的磷酸化在暴露1h和12h達到峰值,而金紅石誘導ERKl/2的激活峰值出現(xiàn)在9 h,早于銳鈦礦的12 h,p-IκBα對兩者的動態(tài)響應規(guī)律則分別呈Bell型和S型分布。MAPK和NF-κB對金紅石與銳鈦礦的差異性動態(tài)響應主要歸因于納米顆粒團聚體的二次粒徑效應,團聚粒徑小的金紅石較銳鈦礦具有更大激活潛能,并誘導下游較強的炎性因子TNFα、A20表達和細胞毒性響應,表明MAPK和NF-κB信號即早應答介導不同TiO2NPs肝炎風險差異。進一步AFM細胞生物力學測定結(jié)果表明TiO2NPs誘導細胞楊氏模量和粘附力顯著增加,細胞彈性減弱,揭示TiO2NPs生物膜界面胞吞作用觸發(fā)細胞骨架重構(gòu)可能是其對信號通路間接激活的潛在機制。(3) MAPK和NF-κB通路對MCLR與TiO2NPs復合暴露呈協(xié)同與拮抗響應在10-1000μg/L MCLR和10-40 μg/mL TiO2NPs復合暴露下,HepG2細胞內(nèi)MAPK通路中的ERK1/2、p38磷酸化水平較單一暴露顯著增強(p0.05),而NF-κB通路中IκBα磷酸化水平較單一暴露有所降低。MAPK和NF-κB動態(tài)響應規(guī)律亦表明MCLR和TiO2NPs復合暴露促進ERK1/2、p38最大磷酸化進程,其中ERK1/2激活峰值從12h提早至8h,p38從4h提早至1h；而對于NF-κB通路,MCLR減弱TiO2NPs誘導的IκBα磷酸化程度,但未改變其動態(tài)變化規(guī)律。炎癥信號通路激活響應面分析及藥物交互作用指數(shù)表明MCLR與TiO2NPs復合暴露對MAPK激活呈協(xié)同或相加作用,而對NF-κB激活呈拮抗作用。MCLR與TiO2NPs復合體系動態(tài)光散射分析表明兩者交互作用顯著降低TiO2NPs表面Zeta電位和銳鈦礦團聚粒徑,可改變所吸附MCLR的細胞轉(zhuǎn)運從而介導胞內(nèi)炎癥信號通路復合應激響應。
【關鍵詞】：微囊藻毒素 納米二氧化鈦 肝炎 MAPK/NF-κB信號通路 敏感標記物
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 縮寫詞表12-17
• 第一章 緒論17-47
• 1.1 環(huán)境典型微污染及其暴露風險17-28
• 1.1.1 MCs與TiO_2NPs微污染環(huán)境典型意義17-22
• 1.1.2 MCs與TiO_2NPs單一及復合暴露風險22-27
• 1.1.3 環(huán)境微污染暴露評價研究方法27-28
• 1.2 典型微污染健康損傷機制及其預警研究方法28-37
• 1.2.1 MCs肝毒作用機制29-31
• 1.2.2 TiO_2NPs納米毒性及其分子機制31-34
• 1.2.3 微污染健康風險預警分子標記物研究進展34-37
• 1.3 細胞炎癥信號通路及其調(diào)控機制37-44
• 1.3.1 MAPK/NF-κB通路信號轉(zhuǎn)導調(diào)控38-42
• 1.3.2 MAPK/NF-κB可逆磷酸化信號轉(zhuǎn)導研究方法42-43
• 1.3.3 MAPK/NF-κB信號通路對環(huán)境微污染應激響應43-44
• 1.4 本論文研究工作44-47
• 1.4.1 研究目標和意義44
• 1.4.2 擬解決的科學問題44-45
• 1.4.3 研究內(nèi)容和技術路線45-47
• 第二章 MCLR誘導MAPK/NF-κB信號通路脅迫響應47-66
• 2.1 前言47-48
• 2.2 材料與方法48-54
• 2.2.1 材料與儀器48-51
• 2.2.2 肝細胞模型篩選51
• 2.2.3 細胞暴露濃度梯度及毒性測定51-52
• 2.2.4 MAPK與NF-κB信號轉(zhuǎn)導檢測52-53
• 2.2.5 IL-6表達ELISA測定53-54
• 2.2.6 細胞亞顯微結(jié)構(gòu)損傷表征54
• 2.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析54
• 2.3 結(jié)果54-64
• 2.3.1 原代肝細胞與離體肝細胞系對MCLR的敏感性差異54-55
• 2.3.2 HepG2細胞NF-κB/MAPK信號通路對MCLR應激響應55-59
• 2.3.3 原代肝細胞NF-κB/MAPK信號通路對MCLR應激響應59-61
• 2.3.4 MCLR誘導肝細胞炎性因子IL-6表達61-63
• 2.3.5 MCLR對肝細胞亞顯微結(jié)構(gòu)的損傷63-64
• 2.4 討論64-65
• 2.5 小結(jié)65-66
• 第三章 TiO_2NPs誘導MAPK/2NF-κB信號轉(zhuǎn)導機制66-85
• 3.1 前言66-67
• 3.2 材料與方法67-71
• 3.2.1 實驗材料67
• 3.2.2 細胞培養(yǎng)與暴露67-68
• 3.2.3 肝細胞毒性測定68
• 3.2.4 MAPK與NF-κB信號轉(zhuǎn)導檢測68-69
• 3.2.5 炎性因子mRNA表達測定69
• 3.2.6 細胞亞顯微結(jié)構(gòu)損傷表征69-71
• 3.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析71
• 3.3 結(jié)果71-83
• 3.3.1 TiO_2NPs團聚特性71-73
• 3.3.2 TiO_2NPs肝細胞毒性73-75
• 3.3.3 TiO_2NPs誘導MAPK/NF-κB信號通路動態(tài)激活規(guī)律75-80
• 3.3.4 TiO_2NPs誘導炎性因子表達80-81
• 3.3.5 TiO_2NPs對肝細胞亞顯微結(jié)構(gòu)的損傷81-83
• 3.4 討論83-84
• 3.5 小結(jié)84-85
• 第四章 MCLR與TiO_2NPs對MAPK/NF-κB信號轉(zhuǎn)導復合作用85-99
• 4.1 前言85-86
• 4.2 材料與方法86-87
• 4.2.1 混合體系理化特性鑒定86
• 4.2.2 肝細胞毒性測定86
• 4.2.3 MAPK與NF-κB信號通路激活86-87
• 4.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析87
• 4.3 結(jié)果87-96
• 4.3.1 MCLR對TiO_2NPs團聚特性影響87-88
• 4.3.2 MCLR與TiO_2NPs復合肝細胞毒性88-89
• 4.3.3 MCLR與TiO_2NPs對MAPK/NF-κB激活的復合效應89-94
• 4.3.4 MCLR與TiO_2NPs復合誘導MAPK/NF-κB動態(tài)激活規(guī)律94-96
• 4.4 討論96-98
• 4.5 小結(jié)98-99
• 第五章 研究結(jié)論、創(chuàng)新點與展望99-102
• 5 .1研究結(jié)論99-100
• 5.2 創(chuàng)新點100-101
• 5.3 展望101-102
• 參考文獻102-126
• 作者簡介及攻讀博士學位期間完成的學術論文126

  本文關鍵詞：MCLR與TiO_2NPs肝細胞暴露的炎癥信號響應，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：286725