本文關(guān)鍵詞：MCLR與TiO_2NPs肝細胞暴露的炎癥信號響應(yīng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：針對環(huán)境微污染人體健康的毒性預(yù)警問題,面對中國南方水體微囊藻毒素污染誘導(dǎo)的化學(xué)性損傷和局部水源中納米材料污染帶來的物理性損傷,本研究選取典型微囊藻毒素(MCLR)和兩種納米二氧化鈦(TiO2NPs)材料(銳鈦礦和金紅石),采用體外原代與離體肝細胞系實驗?zāi)Ｐ?突破肝細胞敏感炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫風(fēng)險表達技術(shù),解析細胞亞顯微結(jié)構(gòu)應(yīng)激損傷及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)潛在機制,揭示炎癥信號通路MAPK和NF-κB對MCLR與TiO2NPs單一及復(fù)合暴露響應(yīng)的劑量效應(yīng)規(guī)律,提供環(huán)境微污染早期肝炎風(fēng)險敏感預(yù)警方法。主要研究結(jié)果如下：(1)MAPK和NF-κB炎癥信號通路被MCLR磷酸化激活介導(dǎo)其肝炎風(fēng)險1-1000μg/L MCLR暴露24h后,引起原代小鼠肝細胞(PMHs)活力顯著下降p0.05),其蛋白降解EC50值為11.86±1.01-14.49±3.74μg/L；而在人肝細胞系(HepG2)內(nèi)未引起顯著細胞毒性,表明原代肝細胞PMHs對MCLR響應(yīng)較HepG2更為敏感。運用免疫印跡和熒光素酶報告系統(tǒng)測定炎癥信號通路MAPK和NF-κB激活結(jié)果表明亞細胞致死劑量MCLR引起PMHs(25μg/L)和HepG2(1000μg/L)細胞內(nèi)MAPK和NF-κB顯著磷酸化激活(p0.05)。MAPK和NF-κB通路激活介導(dǎo)下游炎性因子IL-6蛋白表達上調(diào),證實MCLR對肝細胞的促炎作用。MAPK和NF-κB對MCLR和炎性因子TNFa復(fù)合暴露的激活響應(yīng)表明MCLR預(yù)暴露使肝細胞呈高敏狀態(tài)促進TNFa誘導(dǎo)的MAPK和NF-κB通路激活及IL-6表達,有效指示炎癥敏感人群MCLR二次暴露風(fēng)險。TEM亞顯微結(jié)構(gòu)觀察進一步指出PMHs內(nèi)線粒體對MCLR暴露最為敏感,在大于25μg/L劑量下其雙層膜破裂,內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)和基質(zhì)流失,表明線粒體結(jié)構(gòu)損傷可能介導(dǎo)MAPK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)。(2) MAPK和NF-κB通路對TiO2NPs差異性動態(tài)響應(yīng)受其團聚形態(tài)調(diào)控TiO2NPs在高于160μg/mL劑量下致肝細胞HepG2顯著死亡(p0.05),金紅石細胞毒性強于銳鈦礦。在亞細胞致死劑量5-160μg/mL TiO2NPs暴露下,HepG2內(nèi)MAPK通路中的ERK1/2、p38及NF-κB通路中的IκBα磷酸化表達顯著上調(diào)p0.05),與暴露劑量呈正相關(guān)。兩種TiO2NPs誘導(dǎo)MAPK和NF-κB動態(tài)激活規(guī)律在24h暴露內(nèi)存在差異,金紅石與銳鈦礦對p38的磷酸化在暴露1h和12h達到峰值,而金紅石誘導(dǎo)ERKl/2的激活峰值出現(xiàn)在9 h,早于銳鈦礦的12 h,p-IκBα對兩者的動態(tài)響應(yīng)規(guī)律則分別呈Bell型和S型分布。MAPK和NF-κB對金紅石與銳鈦礦的差異性動態(tài)響應(yīng)主要歸因于納米顆粒團聚體的二次粒徑效應(yīng),團聚粒徑小的金紅石較銳鈦礦具有更大激活潛能,并誘導(dǎo)下游較強的炎性因子TNFα、A20表達和細胞毒性響應(yīng),表明MAPK和NF-κB信號即早應(yīng)答介導(dǎo)不同TiO2NPs肝炎風(fēng)險差異。進一步AFM細胞生物力學(xué)測定結(jié)果表明TiO2NPs誘導(dǎo)細胞楊氏模量和粘附力顯著增加,細胞彈性減弱,揭示TiO2NPs生物膜界面胞吞作用觸發(fā)細胞骨架重構(gòu)可能是其對信號通路間接激活的潛在機制。(3) MAPK和NF-κB通路對MCLR與TiO2NPs復(fù)合暴露呈協(xié)同與拮抗響應(yīng)在10-1000μg/L MCLR和10-40 μg/mL TiO2NPs復(fù)合暴露下,HepG2細胞內(nèi)MAPK通路中的ERK1/2、p38磷酸化水平較單一暴露顯著增強(p0.05),而NF-κB通路中IκBα磷酸化水平較單一暴露有所降低。MAPK和NF-κB動態(tài)響應(yīng)規(guī)律亦表明MCLR和TiO2NPs復(fù)合暴露促進ERK1/2、p38最大磷酸化進程,其中ERK1/2激活峰值從12h提早至8h,p38從4h提早至1h；而對于NF-κB通路,MCLR減弱TiO2NPs誘導(dǎo)的IκBα磷酸化程度,但未改變其動態(tài)變化規(guī)律。炎癥信號通路激活響應(yīng)面分析及藥物交互作用指數(shù)表明MCLR與TiO2NPs復(fù)合暴露對MAPK激活呈協(xié)同或相加作用,而對NF-κB激活呈拮抗作用。MCLR與TiO2NPs復(fù)合體系動態(tài)光散射分析表明兩者交互作用顯著降低TiO2NPs表面Zeta電位和銳鈦礦團聚粒徑,可改變所吸附MCLR的細胞轉(zhuǎn)運從而介導(dǎo)胞內(nèi)炎癥信號通路復(fù)合應(yīng)激響應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：微囊藻毒素 納米二氧化鈦 肝炎 MAPK/NF-κB信號通路 敏感標(biāo)記物
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 縮寫詞表12-17
• 第一章 緒論17-47
• 1.1 環(huán)境典型微污染及其暴露風(fēng)險17-28
• 1.1.1 MCs與TiO_2NPs微污染環(huán)境典型意義17-22
• 1.1.2 MCs與TiO_2NPs單一及復(fù)合暴露風(fēng)險22-27
• 1.1.3 環(huán)境微污染暴露評價研究方法27-28
• 1.2 典型微污染健康損傷機制及其預(yù)警研究方法28-37
• 1.2.1 MCs肝毒作用機制29-31
• 1.2.2 TiO_2NPs納米毒性及其分子機制31-34
• 1.2.3 微污染健康風(fēng)險預(yù)警分子標(biāo)記物研究進展34-37
• 1.3 細胞炎癥信號通路及其調(diào)控機制37-44
• 1.3.1 MAPK/NF-κB通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控38-42
• 1.3.2 MAPK/NF-κB可逆磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方法42-43
• 1.3.3 MAPK/NF-κB信號通路對環(huán)境微污染應(yīng)激響應(yīng)43-44
• 1.4 本論文研究工作44-47
• 1.4.1 研究目標(biāo)和意義44
• 1.4.2 擬解決的科學(xué)問題44-45
• 1.4.3 研究內(nèi)容和技術(shù)路線45-47
• 第二章 MCLR誘導(dǎo)MAPK/NF-κB信號通路脅迫響應(yīng)47-66
• 2.1 前言47-48
• 2.2 材料與方法48-54
• 2.2.1 材料與儀器48-51
• 2.2.2 肝細胞模型篩選51
• 2.2.3 細胞暴露濃度梯度及毒性測定51-52
• 2.2.4 MAPK與NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)檢測52-53
• 2.2.5 IL-6表達ELISA測定53-54
• 2.2.6 細胞亞顯微結(jié)構(gòu)損傷表征54
• 2.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析54
• 2.3 結(jié)果54-64
• 2.3.1 原代肝細胞與離體肝細胞系對MCLR的敏感性差異54-55
• 2.3.2 HepG2細胞NF-κB/MAPK信號通路對MCLR應(yīng)激響應(yīng)55-59
• 2.3.3 原代肝細胞NF-κB/MAPK信號通路對MCLR應(yīng)激響應(yīng)59-61
• 2.3.4 MCLR誘導(dǎo)肝細胞炎性因子IL-6表達61-63
• 2.3.5 MCLR對肝細胞亞顯微結(jié)構(gòu)的損傷63-64
• 2.4 討論64-65
• 2.5 小結(jié)65-66
• 第三章 TiO_2NPs誘導(dǎo)MAPK/2NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制66-85
• 3.1 前言66-67
• 3.2 材料與方法67-71
• 3.2.1 實驗材料67
• 3.2.2 細胞培養(yǎng)與暴露67-68
• 3.2.3 肝細胞毒性測定68
• 3.2.4 MAPK與NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)檢測68-69
• 3.2.5 炎性因子mRNA表達測定69
• 3.2.6 細胞亞顯微結(jié)構(gòu)損傷表征69-71
• 3.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析71
• 3.3 結(jié)果71-83
• 3.3.1 TiO_2NPs團聚特性71-73
• 3.3.2 TiO_2NPs肝細胞毒性73-75
• 3.3.3 TiO_2NPs誘導(dǎo)MAPK/NF-κB信號通路動態(tài)激活規(guī)律75-80
• 3.3.4 TiO_2NPs誘導(dǎo)炎性因子表達80-81
• 3.3.5 TiO_2NPs對肝細胞亞顯微結(jié)構(gòu)的損傷81-83
• 3.4 討論83-84
• 3.5 小結(jié)84-85
• 第四章 MCLR與TiO_2NPs對MAPK/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合作用85-99
• 4.1 前言85-86
• 4.2 材料與方法86-87
• 4.2.1 混合體系理化特性鑒定86
• 4.2.2 肝細胞毒性測定86
• 4.2.3 MAPK與NF-κB信號通路激活86-87
• 4.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析87
• 4.3 結(jié)果87-96
• 4.3.1 MCLR對TiO_2NPs團聚特性影響87-88
• 4.3.2 MCLR與TiO_2NPs復(fù)合肝細胞毒性88-89
• 4.3.3 MCLR與TiO_2NPs對MAPK/NF-κB激活的復(fù)合效應(yīng)89-94
• 4.3.4 MCLR與TiO_2NPs復(fù)合誘導(dǎo)MAPK/NF-κB動態(tài)激活規(guī)律94-96
• 4.4 討論96-98
• 4.5 小結(jié)98-99
• 第五章 研究結(jié)論、創(chuàng)新點與展望99-102
• 5 .1研究結(jié)論99-100
• 5.2 創(chuàng)新點100-101
• 5.3 展望101-102
• 參考文獻102-126
• 作者簡介及攻讀博士學(xué)位期間完成的學(xué)術(shù)論文126

  本文關(guān)鍵詞：MCLR與TiO_2NPs肝細胞暴露的炎癥信號響應(yīng)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：286725