本文關(guān)鍵詞：NDM-1耐藥菌在中國的流行及特性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近些年來,革蘭陰性桿菌的耐藥情況日益嚴(yán)重,主要以腸桿菌科細菌和非發(fā)酵革蘭陰性桿菌為主,而耐碳氫酶烯類抗生素耐藥菌的不斷出現(xiàn)加劇了這種情況,臨床上以肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌耐藥最為嚴(yán)重,使感染性疾病的治療陷入困境。2009年,產(chǎn)NDM-1(新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶)耐藥菌的出現(xiàn)和流行引起了世界范圍內(nèi)的恐慌,攜帶NDM-1的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌表現(xiàn)出了超強的耐藥性,對包括碳青霉烯類在內(nèi)的臨床常用的抗生素耐藥,到2011年,在全球范圍內(nèi)超過20個國家出現(xiàn)了NDM-1耐藥菌的報道,多數(shù)患者有印度等國家醫(yī)療旅行史,越來越多的數(shù)據(jù)表明產(chǎn)NDM-1的耐藥菌已經(jīng)呈全球范圍播散趨勢,有可能成為威脅人類健康的巨大隱患。目前,我國產(chǎn)NDM-1耐藥菌的流行情況、攜帶NDM-1菌株的特性及其播散的機制仍不清楚。國外NDM-1攜帶者多有印度和巴基斯坦旅行和醫(yī)療史,印度被認(rèn)為是NDM-1耐藥菌的輸出國家,我國與印度毗鄰,其NDM-1耐藥菌的流行是否和印度有關(guān)仍沒有明確定論。研究證明人體腸道是重要的耐藥基因庫,致病菌可以在腸道內(nèi)發(fā)生接合轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因,在腸道定植的菌中攜帶的耐藥基因有一半與致病菌中相同,因此美國疾病預(yù)防控制中心推薦通過采集患者糞便標(biāo)本來篩查CRE(耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌)攜帶者,以便及時采取措施預(yù)防和控制感染�；谏鲜鲅芯�,我們從2011年4月至2011年10月,在全國范圍內(nèi)選取了11個城市22家醫(yī)院,共收集了3001份糞便樣本,常規(guī)PCR和陽性產(chǎn)物再測序篩選NDM-1陽性樣本,然后從鑒定為陽性的樣本中分離出NDM-1耐藥菌,利用BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)和16S rRNA基因測序進行菌種鑒定。其中對分離出的不動桿菌屬細菌再次利用16S-23S rRNA ITS區(qū)序列和rpoB基因序列測序進行菌種鑒定。在篩查的3001份樣本中,一共鑒定出329份陽性樣本,平均陽性率為11%,陽性率較高的城市有重慶(17.6%)和成都(17.2%),較低的有南京(4.0%)和烏魯木齊(4.4%),在所有調(diào)查的城市中均存在陽性樣本。從329份陽性的菌液中,一共分離出63株NDM-1陽性菌,菌種鑒定結(jié)果顯示數(shù)目最多的是不動桿菌屬細菌(30株),其次是腸球菌(10株)。含NDM-1的菌種種類較多,分別屬于不同的16個屬的細菌,其中共發(fā)現(xiàn)18個未報道過的含NDM-1的耐藥菌。另外我們發(fā)現(xiàn)有些陽性樣本分離出不止一株NDM-1耐藥菌,其中有9個樣本每個樣本分離出2個不同的NDM-1耐藥菌,還有1個樣本分離出3株不同的NDM-1陽性菌,在這10個特殊的樣本中有9個樣本中分離的菌中含有不動桿菌。另外病例資料顯示我們收集的患者均無出國醫(yī)療史。通過上述研究我們發(fā)現(xiàn)NDM-1耐藥菌在醫(yī)院患者身上攜帶率較高,已經(jīng)在全國范圍內(nèi)流行和傳播；我國分離的NDM-1菌株的菌種類型獨特,以不動桿菌屬細菌(30/63)和腸球菌屬細菌(10/63)多見；不動桿菌屬細菌在中國NDM-1的傳播過程中起到了重要作用,不動桿菌屬細菌可能是NDM-1基因的保存宿主；我國的NDM-1耐藥菌的流行與印度可能無關(guān)。我們對NDM-1耐藥菌的特性進行了進一步研究,首先在有抗和無抗條件下連續(xù)傳代,分析blaNDM-1基因在菌株中的遺傳穩(wěn)定性。Walsh等的研究表明不能夠穩(wěn)定遺傳6blaNDM-1基因的菌株不具備典型的NDM-1耐藥菌的耐藥性,所以我們對能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因的菌株進行重點研究,首先微量肉湯稀釋法和E-test法檢測菌株對抗菌藥物的敏感性,E-test法檢測細菌金屬酶表型；然后PCR法篩選常見的耐藥基因,分析菌株的耐藥基因背景；PFGE對細菌分型,查看有無流行克隆株；Southern blot對b laNDM-1進行基因定位；接合轉(zhuǎn)移實驗評估blaNDM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)移特性,同時微量肉湯稀釋法評估了blaNDM-1陽性接合子的耐藥性。我們發(fā)現(xiàn)在63株NDM-1耐藥菌中只有30株不動桿菌屬的細菌能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因,在有抗和無抗的壓力下連續(xù)培養(yǎng)5代,所有的菌株未出現(xiàn)blaNDM-1基因丟失現(xiàn)象,然而其余菌株,包括一株大腸埃希菌和產(chǎn)酸克雷伯菌在內(nèi)的15個屬種的細菌在無抗的壓力下連續(xù)傳代培養(yǎng)1-3代,blaNDM-1基因均發(fā)生丟失。體外的藥敏實驗表明30株不動桿菌表現(xiàn)出相似的表型耐藥模式,對頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)出高水平耐藥,對氨基糖苷類抗生素、喹諾酮類抗生素及單酰胺環(huán)類抗生素(氨曲南)耐藥表現(xiàn)不一致：10株測試菌對氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)為敏感,其余菌株(20/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥；3株測試菌對喹諾酮類抗生素表現(xiàn)為敏感,其余菌株(27/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥；17株測試菌對氨曲南表現(xiàn)為敏感,其余菌株(13/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥；30株測試株中,29株對替加環(huán)素表現(xiàn)為敏感,24株對黏菌素表現(xiàn)為敏感。攜帶NDM-1的不動桿菌屬細菌金屬酶表型均為陽性。耐藥基因背景篩查結(jié)果顯示在30株不動桿菌屬細菌,有22株細菌含有其他耐藥基因。PFGE結(jié)果顯示不動桿菌屬細菌帶型差異較大,沒有發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢克隆株。Southern blot結(jié)果顯示30個不動桿菌中有26個菌blaNDM-1位于質(zhì)粒上,質(zhì)粒大小相似,在30-60kb范圍內(nèi),其余4個菌blaNDM-1位于染色體上。接合轉(zhuǎn)移實驗顯示有23個菌株中的blaNDM-1質(zhì)粒發(fā)生了轉(zhuǎn)移,接合轉(zhuǎn)移效率較高,達到10-2,同時藥敏結(jié)果顯示陽性接合子普遍對頭孢菌素類抗生素表現(xiàn)為耐藥,然而只有部分菌株(8/23)遺傳NDM-1原始菌株的耐藥性,對碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)耐藥,其余接合子(15/23)對其表現(xiàn)敏感。通過上述研究我們發(fā)現(xiàn)NDM-1陽性的不動桿菌屬細菌并非泛耐藥菌,體外實驗表明除替加環(huán)素和黏菌素外,多數(shù)菌株還對氨曲南保持敏感。blaNDM-1基因能夠穩(wěn)定地存在于不動桿菌攜帶的質(zhì)粒上,并且這些質(zhì)粒能夠高效地發(fā)生接合轉(zhuǎn)移,這對blaNDM-1基因的傳播具有重要意義。為了研究blaNDM-1基因所在的質(zhì)粒及周圍序列特征,以期從分子水平上揭示耐藥基因的產(chǎn)生及傳播機制。本研究提取細菌的質(zhì)粒利用Ion TorrentTM平臺進行測序,然后普通PCR測序補充gap,同時驗證質(zhì)粒全序。RAST對質(zhì)粒進行注釋,Blastp進行驗證。利用Mauve和CLC Genomics Workbench軟件對所有blaNDM-1質(zhì)粒進行分析,對比所有的質(zhì)粒,找出它們的區(qū)別和差異,同時對blaNDM-1基因上下游序列進行分析,對于blaNDM-1基因位于染色體上的4個菌,PCR mapping推測其上下游序列。結(jié)合有關(guān)NDM-1的文獻,推測NDM-1的傳播和流行規(guī)律。blaNDM-1質(zhì)粒測序結(jié)果顯示,有14個質(zhì)粒與已經(jīng)公布的4個質(zhì)粒相同(pNDM-BJ01、pNDM-BJ02、pM131_NDM-1和pAbNDM-1),這4個質(zhì)粒本身之問相似性較高,達到80%；另外10個質(zhì)粒為新的質(zhì)粒,對比分析之后,發(fā)現(xiàn)這10個質(zhì)粒與上述的4個質(zhì)粒仍然有較高的相似性(70%-90%)。由此我們得到不動桿菌屬細菌中blaNDM-1質(zhì)粒保守,質(zhì)粒問的相似程度較高,質(zhì)粒的不同多為在轉(zhuǎn)移的過程中不動桿菌屬細菌中常見的插入序列整合引起的。同時實驗發(fā)現(xiàn)兩個結(jié)構(gòu)全新的質(zhì)粒,pNDM-GJO1和pNDM-GJ02, pNDM-GJ01擁有一個新的質(zhì)粒骨架,BLAST結(jié)果顯示除了Tn125外,NCBI中沒有與pNDM-GJ01相似的序列。另外對pNDM-GJ02的結(jié)構(gòu)進行分析顯示,質(zhì)粒pNDM-GJ02上有兩段分別與鮑曼不動桿菌中質(zhì)粒pBJAB0715和Acinetobacter sp. MDS7A染色體上序列有較高的同源性(97%-100%),除此之外,質(zhì)粒還含兩個完整的復(fù)合轉(zhuǎn)座子,Tn125和IS26復(fù)合轉(zhuǎn)座子,pNDM-GJ02質(zhì)粒的形成可能是由多次重組事件造成的。由此不動桿菌屬細菌中b laNDM-1新質(zhì)粒的產(chǎn)生是Tn125移動整合的結(jié)果。blaNDM-1基因通過轉(zhuǎn)奎元件在不同質(zhì)粒問傳播,繼而以質(zhì)粒為轉(zhuǎn)移元件繼續(xù)播散。通過比對30株不動桿菌屬細菌中blaNDM-1基因周圍序列,發(fā)現(xiàn)blaNDM-1位于Tn125-like結(jié)構(gòu)上,周圍序列非常保守。結(jié)合文獻我們認(rèn)為blaNDM-1基因可能來源于不動桿菌屬細菌,不動桿菌屬細菌是blaNDM-1基因的天然宿主,blaNDM-1基因可以通過轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)移至肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中,再次引起爆發(fā)流行。另外我們發(fā)現(xiàn)了NDM-1的一個新的突變體,命名為NDM-14。為了研究新的突變體的特性,首先比較攜帶NDM-1和NDM-14原始菌株的耐藥性差別,同時構(gòu)建兩種克隆株比較耐藥性差異,最后利用合適的載體,經(jīng)過兩次純化得到無標(biāo)簽的NDM蛋白,通過酶動力學(xué)實驗研究酶的各項特征。實驗結(jié)果顯示,與攜帶NDM-1的菌株相比,攜帶NDM-14的菌株耐藥性增強,這種情況在原始啟動子存在的情況下尤為明顯。酶動力參數(shù)表明,與NDM-1相比,NDM-14對美羅培南,亞胺培南和氨芐西林的親和力增強。宗上所述,推測：1)我國產(chǎn)NDM-1菌株是個獨立進化的過程,NDM-1耐藥基因的傳播與印度無關(guān),傳播主要由攜帶相似質(zhì)粒的不動桿菌屬細菌造成的；2)產(chǎn)NDM-1菌株同時具有跨國流行及個別地方流行的特點,許多地方可能本身就有MDM-1菌株的流行,當(dāng)印度的產(chǎn)NDM-1菌株因醫(yī)療旅行傳至全球多個國家后,引起了廣泛關(guān)注,這種廣泛關(guān)注增加了產(chǎn)NDM-1菌的檢出率；3)blaNDM-1基因可能會再次爆發(fā)流行,菌株主要集中在肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌。
【關(guān)鍵詞】：NDM-1 不動桿菌屬細菌 bla_(NDM-1)質(zhì)粒 Tn125
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R446.5
【目錄】：

• 縮略詞表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-17
• 前言17-20
• 第一部分：產(chǎn)NDM-1 耐藥菌在中國的流行研究20-39
• 引言20-21
• 1 實驗材料21-22
• 1.1 培養(yǎng)基21
• 1.2 試劑和藥品21
• 1.3 緩沖液21
• 1.4 儀器設(shè)備21-22
• 2 實驗方法22-25
• 2.1 樣本采集22-23
• 2.2 樣本處理23
• 2.3 blaNDM-1陽性樣本篩查23-24
• 2.4 blaNDM-1陽性菌的分離24
• 2.5 blaNDM-1 陽性菌的菌種鑒定24-25
• 3 結(jié)果25-36
• 3.1 各地區(qū)blaNDM-1陽性樣本率統(tǒng)計和分析25-31
• 3.2 blaNDM-1陽性菌的菌種鑒定結(jié)果及病例資料31-36
• 4 討論36-38
• 5 小結(jié)38-39
• 第二部分 產(chǎn)NDM-1 菌株的特性研究39-67
• 引言39
• 1 實驗材料39-43
• 1.1 培養(yǎng)基39-40
• 1.2 試劑和藥品40
• 1.3 緩沖液40-43
• 1.4 儀器設(shè)備43
• 2 研究方法43-53
• 2.1 blaNDM-1基因遺傳穩(wěn)定性研究43
• 2.2 不動桿菌屬細菌菌種再次鑒定43-45
• 2.3 微量肉湯稀釋法和E-test法檢測菌株對抗菌藥物的敏感性45-46
• 2.4 E-test法檢測細菌金屬酶表型46-47
• 2.5 PCR檢測常見的耐藥基因47-49
• 2.6 PFGE對細菌分型49-50
• 2.7 Southern blot對blaNDM-1進行基因定位50-51
• 2.8 接合轉(zhuǎn)移實驗評估blaNDM-l質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移特性51-52
• 2.9 微量肉湯稀釋法評估blaNDM-1陽性接合子的耐藥性52-53
• 3 結(jié)果53-63
• 3.1 blaNDM-1基因遺傳穩(wěn)定性分析53-54
• 3.2 不動桿菌屬細菌菌種鑒定結(jié)果54-55
• 3.3 blaNDM-1陽性菌藥敏結(jié)果及金屬酶表型分析55-58
• 3.4 協(xié)同耐藥基因分析58
• 3.5 blaNDM-1陽性菌PFGE分型結(jié)果58-59
• 3.6 blaNDM-1基因定位結(jié)果59-60
• 3.7 blaNDM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)移特性分析60-61
• 3.8 blaNDM-1陽性接合子的藥敏結(jié)果61-63
• 4 討論63-66
• 5 小結(jié)66-67
• 第三部分 含NDM-1 基因不動桿菌屬細菌的分子遺傳學(xué)研究67-89
• 引言67-68
• 1 實驗材料68-69
• 1.1 培養(yǎng)基68
• 1.2 試劑和藥品68
• 1.3 緩沖液68
• 1.4 儀器設(shè)備68-69
• 2 實驗方法69-75
• 2.1 試劑盒提取質(zhì)粒DNA69
• 2.2 blaNDM-1質(zhì)粒的高通量測序69-74
• 2.3 BLAST和Mauve對質(zhì)粒的相似性進行分析74
• 2.4 blaNDM-1基因周圍結(jié)構(gòu)分析74-75
• 2.5 NDM-1 文獻簡要分析75
• 3 結(jié)果75-85
• 3.1 質(zhì)粒的全序及注釋結(jié)果75-76
• 3.2 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及相似性分析76-79
• 3.3 Tn125 相關(guān)的兩個全新質(zhì)粒結(jié)構(gòu)分析79-82
• 3.4 blaNDM-1基因周圍序列結(jié)構(gòu)分析82-83
• 3.5 NDM-1 文獻簡要分析83-85
• 4 討論85-88
• 5 小結(jié)88-89
• 第四部分 NDM-14 的特性研究89-106
• 引言89
• 1 實驗材料89-92
• 1.1 培養(yǎng)基89
• 1.2 菌株及質(zhì)粒89
• 1.3 試劑和藥品89-90
• 1.4 緩沖液90-91
• 1.5 儀器設(shè)備91-92
• 2 實驗方法92-97
• 2.1 NDM-1 突變體的驗證和明確92
• 2.2 克隆載體的構(gòu)建92-94
• 2.3 藥敏實驗94
• 2.4 NDM蛋白純化94-96
• 2.5 酶動力學(xué)實驗96-97
• 2.6 NDM-14 所在質(zhì)粒結(jié)構(gòu)分析97
• 3 結(jié)果97-104
• 3.1 NDM-1 突變體的驗證和明確97-98
• 3.2 藥敏結(jié)果98-101
• 3.3 酶動力學(xué)分析101-104
• 4 討論104
• 5 小結(jié)104-106
• 總結(jié)106-107
• 參考文獻107-112
• 文獻綜述112-126
• 參考文獻123-126
• 附表 1126-127
• 附表 2127-128
• 發(fā)表文章128-132
• 攻讀期成果132-134
• 個人簡歷134-135
• 致謝135-136

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 呂媛;李耘;崔蘭卿;;2010年度衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測報告:腸桿菌科細菌耐藥監(jiān)測[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2011年24期

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本文編號：286512