本文關(guān)鍵詞：NDM-1耐藥菌在中國(guó)的流行及特性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近些年來(lái),革蘭陰性桿菌的耐藥情況日益嚴(yán)重,主要以腸桿菌科細(xì)菌和非發(fā)酵革蘭陰性桿菌為主,而耐碳?xì)涿赶╊惪股啬退幘牟粩喑霈F(xiàn)加劇了這種情況,臨床上以肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌耐藥最為嚴(yán)重,使感染性疾病的治療陷入困境。2009年,產(chǎn)NDM-1(新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶)耐藥菌的出現(xiàn)和流行引起了世界范圍內(nèi)的恐慌,攜帶NDM-1的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌表現(xiàn)出了超強(qiáng)的耐藥性,對(duì)包括碳青霉烯類在內(nèi)的臨床常用的抗生素耐藥,到2011年,在全球范圍內(nèi)超過20個(gè)國(guó)家出現(xiàn)了NDM-1耐藥菌的報(bào)道,多數(shù)患者有印度等國(guó)家醫(yī)療旅行史,越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明產(chǎn)NDM-1的耐藥菌已經(jīng)呈全球范圍播散趨勢(shì),有可能成為威脅人類健康的巨大隱患。目前,我國(guó)產(chǎn)NDM-1耐藥菌的流行情況、攜帶NDM-1菌株的特性及其播散的機(jī)制仍不清楚。國(guó)外NDM-1攜帶者多有印度和巴基斯坦旅行和醫(yī)療史,印度被認(rèn)為是NDM-1耐藥菌的輸出國(guó)家,我國(guó)與印度毗鄰,其NDM-1耐藥菌的流行是否和印度有關(guān)仍沒有明確定論。研究證明人體腸道是重要的耐藥基因庫(kù),致病菌可以在腸道內(nèi)發(fā)生接合轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因,在腸道定植的菌中攜帶的耐藥基因有一半與致病菌中相同,因此美國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦通過采集患者糞便標(biāo)本來(lái)篩查CRE(耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌)攜帶者,以便及時(shí)采取措施預(yù)防和控制感染。基于上述研究,我們從2011年4月至2011年10月,在全國(guó)范圍內(nèi)選取了11個(gè)城市22家醫(yī)院,共收集了3001份糞便樣本,常規(guī)PCR和陽(yáng)性產(chǎn)物再測(cè)序篩選NDM-1陽(yáng)性樣本,然后從鑒定為陽(yáng)性的樣本中分離出NDM-1耐藥菌,利用BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)和16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定。其中對(duì)分離出的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌再次利用16S-23S rRNA ITS區(qū)序列和rpoB基因序列測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定。在篩查的3001份樣本中,一共鑒定出329份陽(yáng)性樣本,平均陽(yáng)性率為11%,陽(yáng)性率較高的城市有重慶(17.6%)和成都(17.2%),較低的有南京(4.0%)和烏魯木齊(4.4%),在所有調(diào)查的城市中均存在陽(yáng)性樣本。從329份陽(yáng)性的菌液中,一共分離出63株NDM-1陽(yáng)性菌,菌種鑒定結(jié)果顯示數(shù)目最多的是不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌(30株),其次是腸球菌(10株)。含NDM-1的菌種種類較多,分別屬于不同的16個(gè)屬的細(xì)菌,其中共發(fā)現(xiàn)18個(gè)未報(bào)道過的含NDM-1的耐藥菌。另外我們發(fā)現(xiàn)有些陽(yáng)性樣本分離出不止一株NDM-1耐藥菌,其中有9個(gè)樣本每個(gè)樣本分離出2個(gè)不同的NDM-1耐藥菌,還有1個(gè)樣本分離出3株不同的NDM-1陽(yáng)性菌,在這10個(gè)特殊的樣本中有9個(gè)樣本中分離的菌中含有不動(dòng)桿菌。另外病例資料顯示我們收集的患者均無(wú)出國(guó)醫(yī)療史。通過上述研究我們發(fā)現(xiàn)NDM-1耐藥菌在醫(yī)院患者身上攜帶率較高,已經(jīng)在全國(guó)范圍內(nèi)流行和傳播；我國(guó)分離的NDM-1菌株的菌種類型獨(dú)特,以不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌(30/63)和腸球菌屬細(xì)菌(10/63)多見；不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌在中國(guó)NDM-1的傳播過程中起到了重要作用,不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌可能是NDM-1基因的保存宿主；我國(guó)的NDM-1耐藥菌的流行與印度可能無(wú)關(guān)。我們對(duì)NDM-1耐藥菌的特性進(jìn)行了進(jìn)一步研究,首先在有抗和無(wú)抗條件下連續(xù)傳代,分析blaNDM-1基因在菌株中的遺傳穩(wěn)定性。Walsh等的研究表明不能夠穩(wěn)定遺傳6blaNDM-1基因的菌株不具備典型的NDM-1耐藥菌的耐藥性,所以我們對(duì)能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因的菌株進(jìn)行重點(diǎn)研究,首先微量肉湯稀釋法和E-test法檢測(cè)菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性,E-test法檢測(cè)細(xì)菌金屬酶表型；然后PCR法篩選常見的耐藥基因,分析菌株的耐藥基因背景；PFGE對(duì)細(xì)菌分型,查看有無(wú)流行克隆株；Southern blot對(duì)b laNDM-1進(jìn)行基因定位；接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)評(píng)估blaNDM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)移特性,同時(shí)微量肉湯稀釋法評(píng)估了blaNDM-1陽(yáng)性接合子的耐藥性。我們發(fā)現(xiàn)在63株NDM-1耐藥菌中只有30株不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因,在有抗和無(wú)抗的壓力下連續(xù)培養(yǎng)5代,所有的菌株未出現(xiàn)blaNDM-1基因丟失現(xiàn)象,然而其余菌株,包括一株大腸埃希菌和產(chǎn)酸克雷伯菌在內(nèi)的15個(gè)屬種的細(xì)菌在無(wú)抗的壓力下連續(xù)傳代培養(yǎng)1-3代,blaNDM-1基因均發(fā)生丟失。體外的藥敏實(shí)驗(yàn)表明30株不動(dòng)桿菌表現(xiàn)出相似的表型耐藥模式,對(duì)頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)出高水平耐藥,對(duì)氨基糖苷類抗生素、喹諾酮類抗生素及單酰胺環(huán)類抗生素(氨曲南)耐藥表現(xiàn)不一致：10株測(cè)試菌對(duì)氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)為敏感,其余菌株(20/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥；3株測(cè)試菌對(duì)喹諾酮類抗生素表現(xiàn)為敏感,其余菌株(27/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥；17株測(cè)試菌對(duì)氨曲南表現(xiàn)為敏感,其余菌株(13/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥；30株測(cè)試株中,29株對(duì)替加環(huán)素表現(xiàn)為敏感,24株對(duì)黏菌素表現(xiàn)為敏感。攜帶NDM-1的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌金屬酶表型均為陽(yáng)性。耐藥基因背景篩查結(jié)果顯示在30株不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌,有22株細(xì)菌含有其他耐藥基因。PFGE結(jié)果顯示不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌帶型差異較大,沒有發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)克隆株。Southern blot結(jié)果顯示30個(gè)不動(dòng)桿菌中有26個(gè)菌blaNDM-1位于質(zhì)粒上,質(zhì)粒大小相似,在30-60kb范圍內(nèi),其余4個(gè)菌blaNDM-1位于染色體上。接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示有23個(gè)菌株中的blaNDM-1質(zhì)粒發(fā)生了轉(zhuǎn)移,接合轉(zhuǎn)移效率較高,達(dá)到10-2,同時(shí)藥敏結(jié)果顯示陽(yáng)性接合子普遍對(duì)頭孢菌素類抗生素表現(xiàn)為耐藥,然而只有部分菌株(8/23)遺傳NDM-1原始菌株的耐藥性,對(duì)碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)耐藥,其余接合子(15/23)對(duì)其表現(xiàn)敏感。通過上述研究我們發(fā)現(xiàn)NDM-1陽(yáng)性的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌并非泛耐藥菌,體外實(shí)驗(yàn)表明除替加環(huán)素和黏菌素外,多數(shù)菌株還對(duì)氨曲南保持敏感。blaNDM-1基因能夠穩(wěn)定地存在于不動(dòng)桿菌攜帶的質(zhì)粒上,并且這些質(zhì)粒能夠高效地發(fā)生接合轉(zhuǎn)移,這對(duì)blaNDM-1基因的傳播具有重要意義。為了研究blaNDM-1基因所在的質(zhì)粒及周圍序列特征,以期從分子水平上揭示耐藥基因的產(chǎn)生及傳播機(jī)制。本研究提取細(xì)菌的質(zhì)粒利用Ion TorrentTM平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,然后普通PCR測(cè)序補(bǔ)充gap,同時(shí)驗(yàn)證質(zhì)粒全序。RAST對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行注釋,Blastp進(jìn)行驗(yàn)證。利用Mauve和CLC Genomics Workbench軟件對(duì)所有blaNDM-1質(zhì)粒進(jìn)行分析,對(duì)比所有的質(zhì)粒,找出它們的區(qū)別和差異,同時(shí)對(duì)blaNDM-1基因上下游序列進(jìn)行分析,對(duì)于blaNDM-1基因位于染色體上的4個(gè)菌,PCR mapping推測(cè)其上下游序列。結(jié)合有關(guān)NDM-1的文獻(xiàn),推測(cè)NDM-1的傳播和流行規(guī)律。blaNDM-1質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示,有14個(gè)質(zhì)粒與已經(jīng)公布的4個(gè)質(zhì)粒相同(pNDM-BJ01、pNDM-BJ02、pM131_NDM-1和pAbNDM-1),這4個(gè)質(zhì)粒本身之問相似性較高,達(dá)到80%；另外10個(gè)質(zhì)粒為新的質(zhì)粒,對(duì)比分析之后,發(fā)現(xiàn)這10個(gè)質(zhì)粒與上述的4個(gè)質(zhì)粒仍然有較高的相似性(70%-90%)。由此我們得到不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中blaNDM-1質(zhì)粒保守,質(zhì)粒問的相似程度較高,質(zhì)粒的不同多為在轉(zhuǎn)移的過程中不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中常見的插入序列整合引起的。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)結(jié)構(gòu)全新的質(zhì)粒,pNDM-GJO1和pNDM-GJ02, pNDM-GJ01擁有一個(gè)新的質(zhì)粒骨架,BLAST結(jié)果顯示除了Tn125外,NCBI中沒有與pNDM-GJ01相似的序列。另外對(duì)pNDM-GJ02的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析顯示,質(zhì)粒pNDM-GJ02上有兩段分別與鮑曼不動(dòng)桿菌中質(zhì)粒pBJAB0715和Acinetobacter sp. MDS7A染色體上序列有較高的同源性(97%-100%),除此之外,質(zhì)粒還含兩個(gè)完整的復(fù)合轉(zhuǎn)座子,Tn125和IS26復(fù)合轉(zhuǎn)座子,pNDM-GJ02質(zhì)粒的形成可能是由多次重組事件造成的。由此不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中b laNDM-1新質(zhì)粒的產(chǎn)生是Tn125移動(dòng)整合的結(jié)果。blaNDM-1基因通過轉(zhuǎn)奎元件在不同質(zhì)粒問傳播,繼而以質(zhì)粒為轉(zhuǎn)移元件繼續(xù)播散。通過比對(duì)30株不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中blaNDM-1基因周圍序列,發(fā)現(xiàn)blaNDM-1位于Tn125-like結(jié)構(gòu)上,周圍序列非常保守。結(jié)合文獻(xiàn)我們認(rèn)為blaNDM-1基因可能來(lái)源于不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌,不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌是blaNDM-1基因的天然宿主,blaNDM-1基因可以通過轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)移至肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中,再次引起爆發(fā)流行。另外我們發(fā)現(xiàn)了NDM-1的一個(gè)新的突變體,命名為NDM-14。為了研究新的突變體的特性,首先比較攜帶NDM-1和NDM-14原始菌株的耐藥性差別,同時(shí)構(gòu)建兩種克隆株比較耐藥性差異,最后利用合適的載體,經(jīng)過兩次純化得到無(wú)標(biāo)簽的NDM蛋白,通過酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究酶的各項(xiàng)特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與攜帶NDM-1的菌株相比,攜帶NDM-14的菌株耐藥性增強(qiáng),這種情況在原始啟動(dòng)子存在的情況下尤為明顯。酶動(dòng)力參數(shù)表明,與NDM-1相比,NDM-14對(duì)美羅培南,亞胺培南和氨芐西林的親和力增強(qiáng)。宗上所述,推測(cè)：1)我國(guó)產(chǎn)NDM-1菌株是個(gè)獨(dú)立進(jìn)化的過程,NDM-1耐藥基因的傳播與印度無(wú)關(guān),傳播主要由攜帶相似質(zhì)粒的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌造成的；2)產(chǎn)NDM-1菌株同時(shí)具有跨國(guó)流行及個(gè)別地方流行的特點(diǎn),許多地方可能本身就有MDM-1菌株的流行,當(dāng)印度的產(chǎn)NDM-1菌株因醫(yī)療旅行傳至全球多個(gè)國(guó)家后,引起了廣泛關(guān)注,這種廣泛關(guān)注增加了產(chǎn)NDM-1菌的檢出率；3)blaNDM-1基因可能會(huì)再次爆發(fā)流行,菌株主要集中在肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌。
【關(guān)鍵詞】：NDM-1 不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌 bla_(NDM-1)質(zhì)粒 Tn125
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R446.5
【目錄】：

• 縮略詞表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-17
• 前言17-20
• 第一部分：產(chǎn)NDM-1 耐藥菌在中國(guó)的流行研究20-39
• 引言20-21
• 1 實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 1.1 培養(yǎng)基21
• 1.2 試劑和藥品21
• 1.3 緩沖液21
• 1.4 儀器設(shè)備21-22
• 2 實(shí)驗(yàn)方法22-25
• 2.1 樣本采集22-23
• 2.2 樣本處理23
• 2.3 blaNDM-1陽(yáng)性樣本篩查23-24
• 2.4 blaNDM-1陽(yáng)性菌的分離24
• 2.5 blaNDM-1 陽(yáng)性菌的菌種鑒定24-25
• 3 結(jié)果25-36
• 3.1 各地區(qū)blaNDM-1陽(yáng)性樣本率統(tǒng)計(jì)和分析25-31
• 3.2 blaNDM-1陽(yáng)性菌的菌種鑒定結(jié)果及病例資料31-36
• 4 討論36-38
• 5 小結(jié)38-39
• 第二部分 產(chǎn)NDM-1 菌株的特性研究39-67
• 引言39
• 1 實(shí)驗(yàn)材料39-43
• 1.1 培養(yǎng)基39-40
• 1.2 試劑和藥品40
• 1.3 緩沖液40-43
• 1.4 儀器設(shè)備43
• 2 研究方法43-53
• 2.1 blaNDM-1基因遺傳穩(wěn)定性研究43
• 2.2 不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌菌種再次鑒定43-45
• 2.3 微量肉湯稀釋法和E-test法檢測(cè)菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性45-46
• 2.4 E-test法檢測(cè)細(xì)菌金屬酶表型46-47
• 2.5 PCR檢測(cè)常見的耐藥基因47-49
• 2.6 PFGE對(duì)細(xì)菌分型49-50
• 2.7 Southern blot對(duì)blaNDM-1進(jìn)行基因定位50-51
• 2.8 接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)評(píng)估blaNDM-l質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移特性51-52
• 2.9 微量肉湯稀釋法評(píng)估blaNDM-1陽(yáng)性接合子的耐藥性52-53
• 3 結(jié)果53-63
• 3.1 blaNDM-1基因遺傳穩(wěn)定性分析53-54
• 3.2 不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌菌種鑒定結(jié)果54-55
• 3.3 blaNDM-1陽(yáng)性菌藥敏結(jié)果及金屬酶表型分析55-58
• 3.4 協(xié)同耐藥基因分析58
• 3.5 blaNDM-1陽(yáng)性菌PFGE分型結(jié)果58-59
• 3.6 blaNDM-1基因定位結(jié)果59-60
• 3.7 blaNDM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)移特性分析60-61
• 3.8 blaNDM-1陽(yáng)性接合子的藥敏結(jié)果61-63
• 4 討論63-66
• 5 小結(jié)66-67
• 第三部分 含NDM-1 基因不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌的分子遺傳學(xué)研究67-89
• 引言67-68
• 1 實(shí)驗(yàn)材料68-69
• 1.1 培養(yǎng)基68
• 1.2 試劑和藥品68
• 1.3 緩沖液68
• 1.4 儀器設(shè)備68-69
• 2 實(shí)驗(yàn)方法69-75
• 2.1 試劑盒提取質(zhì)粒DNA69
• 2.2 blaNDM-1質(zhì)粒的高通量測(cè)序69-74
• 2.3 BLAST和Mauve對(duì)質(zhì)粒的相似性進(jìn)行分析74
• 2.4 blaNDM-1基因周圍結(jié)構(gòu)分析74-75
• 2.5 NDM-1 文獻(xiàn)簡(jiǎn)要分析75
• 3 結(jié)果75-85
• 3.1 質(zhì)粒的全序及注釋結(jié)果75-76
• 3.2 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及相似性分析76-79
• 3.3 Tn125 相關(guān)的兩個(gè)全新質(zhì)粒結(jié)構(gòu)分析79-82
• 3.4 blaNDM-1基因周圍序列結(jié)構(gòu)分析82-83
• 3.5 NDM-1 文獻(xiàn)簡(jiǎn)要分析83-85
• 4 討論85-88
• 5 小結(jié)88-89
• 第四部分 NDM-14 的特性研究89-106
• 引言89
• 1 實(shí)驗(yàn)材料89-92
• 1.1 培養(yǎng)基89
• 1.2 菌株及質(zhì)粒89
• 1.3 試劑和藥品89-90
• 1.4 緩沖液90-91
• 1.5 儀器設(shè)備91-92
• 2 實(shí)驗(yàn)方法92-97
• 2.1 NDM-1 突變體的驗(yàn)證和明確92
• 2.2 克隆載體的構(gòu)建92-94
• 2.3 藥敏實(shí)驗(yàn)94
• 2.4 NDM蛋白純化94-96
• 2.5 酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)96-97
• 2.6 NDM-14 所在質(zhì)粒結(jié)構(gòu)分析97
• 3 結(jié)果97-104
• 3.1 NDM-1 突變體的驗(yàn)證和明確97-98
• 3.2 藥敏結(jié)果98-101
• 3.3 酶動(dòng)力學(xué)分析101-104
• 4 討論104
• 5 小結(jié)104-106
• 總結(jié)106-107
• 參考文獻(xiàn)107-112
• 文獻(xiàn)綜述112-126
• 參考文獻(xiàn)123-126
• 附表 1126-127
• 附表 2127-128
• 發(fā)表文章128-132
• 攻讀期成果132-134
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷134-135
• 致謝135-136

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 呂媛;李耘;崔蘭卿;;2010年度衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告:腸桿菌科細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2011年24期

  本文關(guān)鍵詞：NDM-1耐藥菌在中國(guó)的流行及特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：286512