目的:蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)為一種致命性的腦血管疾病,是神經(jīng)外科非常多見的危急重癥,有很高的發(fā)病率和致死致殘率。SAH后早期腦組織的損傷往往發(fā)生在SAH后的72小時內(nèi),這被稱為早期腦損傷(early brain injury,EBI)。這一階段發(fā)生的急性病理生理事件,被認(rèn)為是干預(yù)并治療SAH患者的基礎(chǔ)。白質(zhì)占了人腦組織的一半以上,比灰質(zhì)更容易受到缺血/出血性中風(fēng)的影響。雙亮氨酸拉鏈激酶(Dual leucine zipper kinase,DLK),在結(jié)構(gòu)上屬于混合譜系激酶(Mixed lineage kinase)家族,功能上則是MAPKKK(MAP kinase kinase kinase)中一員。DLK是一種有絲分裂原激活的蛋白激酶-激酶-激酶,控制神經(jīng)發(fā)育過程中的軸突生長,凋亡和神經(jīng)元變性,以及對成年神經(jīng)系統(tǒng)的各種損傷后的神經(jīng)變性。本研究以Sprague Dawley大鼠(SD rats)為研究對象,以頸內(nèi)動脈血管穿刺建立SAH損傷模型。側(cè)腦室注射DLK重組蛋白或DLK腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)進(jìn)行干預(yù),通過神經(jīng)行為學(xué)、免疫熒光(Immunofluorescence,IF)、透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)、磁共振彌散張量成像(Diffusion tensor imaging,DTI)等手段觀察DLK對于大鼠SAH后白質(zhì)軸突損傷的調(diào)節(jié)作用,在重組蛋白或AAV干預(yù)DLK/MKK7/JIP3后通過WB探尋DLK對SAH后軸突損傷的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法:1.使用改良的神經(jīng)功能行為學(xué)Garcia評分、平衡木(Beam Balance)評分和轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)(Rotarod test)以及干濕重法檢測SAH后在EBI期內(nèi)3 h、6 h、12 h、24 h和72 h各時間點(diǎn)大鼠的神經(jīng)損傷和腦水腫,實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)、Western blot檢測上述各時間點(diǎn)的DLK、β淀粉樣蛋白前體蛋白(Beta-amyloid precursor protein,β-APP)。2.側(cè)腦室注射DLK腺相關(guān)病毒或DLK重組蛋白從而下調(diào)或上調(diào)DLK的表達(dá),Garcia、Beam Balance和Rotarod test檢測大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)改變,干濕重法檢測大鼠腦水腫。TEM、DTI檢測大鼠的白質(zhì)軸突損傷,冰凍切片IF檢測β-APP和DLK的表達(dá)。通過WB檢測DLK/MKK7/JIP3/p-JNK/β-APP以探究DLK對SAH后軸突損傷調(diào)節(jié)的機(jī)制。結(jié)果:1.SAH后DLK、β-APP表達(dá)增高并在24 h達(dá)到高峰。神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)在SAH12 h后即出現(xiàn)明顯損傷,腦組織含水量在SAH后24 h后明顯提高。2.抑制DLK可以改善SAH后大鼠的神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn),減輕腦水腫,熒光切片發(fā)現(xiàn)β-APP表達(dá)減少,透射電鏡觀察到軸突亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷大大減輕,DTI也發(fā)現(xiàn)白質(zhì)纖維素的走行和完整性大為改善,過表達(dá)DLK則會使上述改變均被逆轉(zhuǎn)。與對照組相比,敲低DLK后,MKK7表達(dá)會降低,JIP3反而增加,JNK的磷酸化程度會降低,β-APP表達(dá)減少,而過表達(dá)DLK則使得通路中的各蛋白表達(dá)結(jié)果與敲低DLK的結(jié)果相反。敲低MKK7后,上游的DLK表達(dá)無差異,下游的JIP3表達(dá)無差異,JNK的磷酸化程度降低,β-APP表達(dá)無差異。敲低JIP3后,上游的DLK表達(dá)無差異,而MKK7表達(dá)減少,下游的JNK磷酸化下降,β-APP表達(dá)無差異。結(jié)論:1.SAH后EBI期內(nèi),DLK表達(dá)會上升,并產(chǎn)生軸突損傷,DLK的累積以及軸突損傷均在24 h達(dá)到高峰,EBI早期即存在神經(jīng)損傷以及腦水腫。2.大鼠SAH后,抑制DLK具有明顯的神經(jīng)損傷保護(hù)、腦水腫保護(hù)及白質(zhì)軸突保護(hù)作用,而過表達(dá)DLK則會逆轉(zhuǎn)SAH后的神經(jīng)保護(hù)、血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)保護(hù)及白質(zhì)軸突保護(hù)作用,上述作用是通過DLK/MKK7/JIP3/p-JNK參與調(diào)節(jié)SAH后白質(zhì)軸突損傷的從而參與EBI的病理過程。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R743.35
【部分圖文】：

根據(jù)EBI的定義,我們將大鼠分為假手術(shù)組和5個時間點(diǎn)組(3h,6h,12h,24h,72h),統(tǒng)計(jì)各組大鼠的死亡率以及對各大鼠進(jìn)行顱底SAH評分,結(jié)果如下(圖1.3)。2.2 q RT-PCR檢測各組DLK的m RNA含量

為了搞清楚DLK在SAH后皮層下白質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元軸突中的表達(dá)情況,造模后各組大鼠取腦之后,提取組織RNA,運(yùn)用PCR檢測DLK的mRNA含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),DLK的基因表達(dá)在SAH后的EBI期間會增加,與Sham組比較,前12h并無明顯變化,直到12h時,才有了顯著差異的增加,并且在24h增加到了峰值(圖1.4)。2.3 WB檢測各組DLK和β-APP的蛋白表達(dá)量

為了搞清楚DLK在SAH后皮層下白質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元軸突中的表達(dá)情況以及軸突的損傷狀況(β-APP),造模后各組大鼠取腦之后,提取組織RNA,運(yùn)用WB檢測DLK的mRNA含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),DLK的基因表達(dá)在SAH后的EBI期間會增加,與Sham組比較,前12h并無明顯變化,直到12h時,才有了顯著差異的增加,并且在24h增加到了峰值(圖1.5)。2.4神經(jīng)行為學(xué)檢測各組SAH后的神經(jīng)損傷狀況
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本文編號：2866431