第一部分高血壓誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞TXNIP表達(dá)上調(diào)目的:高血壓病程中伴隨著明顯的“氧化-抗氧化”失衡,氧化應(yīng)激是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的重要原因之一。硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)是體內(nèi)重要的促氧化蛋白,在多種病理?xiàng)l件下可以被激活,進(jìn)而促進(jìn)組織細(xì)胞發(fā)生氧化性損傷。本部分主要探討高血壓狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞中TXNIP的表達(dá)變化及其影響機(jī)制。方法:使用“兩腎一夾”(two-kidney and one-clip,2K1C)構(gòu)建高血壓大鼠動(dòng)物模型,將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為:正常對(duì)照組(control)、假手術(shù)組(sham)、高血壓組(hypertension),每組10只。使用無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x定期監(jiān)測(cè)各組大鼠的血壓和心率,排除建模不成功的大鼠。4周后收取各組大鼠心臟、主動(dòng)脈和頸動(dòng)脈進(jìn)行蘇木精-伊紅染色、免疫組化和Western blot檢測(cè);同時(shí)使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血漿血管緊張素(angiotensin,Ang)Ⅱ的濃度。體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),外源性使用Ang Ⅱ刺激細(xì)胞,模擬高血壓狀態(tài)下的內(nèi)皮損傷;檢測(cè)不同濃度和時(shí)間Ang Ⅱ處理后HUVEC中TXNIP的表達(dá)變化。使用Losartan(AT-1R阻斷劑)和Tempol(一種可透膜的抗氧化劑)預(yù)處理HUVEC后,分別使用Western blot和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Ang Ⅱ刺激狀態(tài)下HUVEC中TXNIP的表達(dá)變化。結(jié)果:(1)建模后高血壓組大鼠的血壓逐漸升高,術(shù)后4W時(shí),高血壓組的收縮壓(181±6 vs.120±5 mmHg;P0.01)和舒張壓(156±8 vs.105±3 mmHg;P0.01)均明顯高于假手術(shù)組,各組間心率無顯著變化。(2)與假手術(shù)組相比,高血壓大鼠的心臟質(zhì)量指數(shù)(4.38±0.16vs.3.67±0.19;P0.05)、心肌細(xì)胞面積(586±44 vs.353±27μm~2;P0.01)、頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈中膜厚度(38.28±2.37 vs.23.64±1.68μm;82.04±2.52 vs.54.68±1.43μm;均P0.05)均顯著增加,血漿Ang Ⅱ的濃度也明顯升高(556.18±9.14 vs.501.78±7.16 pg/mL,P0.01)。(3)與假手術(shù)組相比,高血壓大鼠頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈血管組織中TXNIP的蛋白表達(dá)水平明顯升高,免疫組化進(jìn)一步顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞中TXNIP的升高最為顯著。(4)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ可以上調(diào)HUVEC中TXNIP的蛋白表達(dá),且具有一定的時(shí)間依賴性。(5)Losartan和Tempol均可顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的TXNIP表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:高血壓狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細(xì)胞中TXNIP的表達(dá)上調(diào),這一現(xiàn)象可能與Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。第二部分TXNIP對(duì)高血壓大鼠血管內(nèi)皮功能的影響目的:血管內(nèi)皮是血液循環(huán)和血管壁之間的屏障,可以分泌多種血管活性物質(zhì),對(duì)于維持血管張力和血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定具有重要意義。高血壓可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙,但具體的損傷機(jī)制目前仍未完全闡明,本部分主要探討TXNIP對(duì)高血壓大鼠血管內(nèi)皮功能的影響。方法:將32只雄性SD大鼠隨機(jī)分為以下4組(每組8只):假手術(shù)組(sham)、假手術(shù)+TXNIP抑制劑組(sham+Resveratrol)、高血壓組(hypertension)、高血壓+TXNIP抑制劑組(hypertension+Resveratrol)。采用2K1C法構(gòu)建高血壓大鼠模型,建模后第二天予以Resveratrol(2mg/kg/d)或等體積的溶劑灌胃,連續(xù)給藥4W后收取大鼠頸動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈和血漿。血管張力測(cè)定儀檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈的內(nèi)皮依賴性舒張功能。Western blot檢測(cè)大鼠血管組織中TXNIP、e NOS、p-e NOS(ser 1177)以及幾種經(jīng)典的氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(NOX2、NOX4、SOD2、NRF2)的表達(dá)。通過檢測(cè)血漿丙二醛(malondialdehyde,MDA)濃度、SOD活性以及主動(dòng)脈二氫乙啶(dihydroethidium,DHE)染色評(píng)估全身及血管組織的氧化應(yīng)激水平。結(jié)果:(1)Resveratrol可以明顯抑制大鼠頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈血管組織中TXNIP的表達(dá)。(2)與假手術(shù)組相比,高血壓大鼠胸主動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)明顯減退,同時(shí)血管組織中e NOS的蛋白表達(dá)和p-e NOS(ser 1177)/e NOS比率明顯減低(均P0.05);抑制TXNIP可以顯著改善高血壓大鼠血管的舒張功能,同時(shí)上調(diào)血管組織中e NOS的蛋白表達(dá)和功能激活(均P0.05)。(3)高血壓大鼠全身及血管組織出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激;與高血壓大鼠相比,抑制TXNIP后高血壓大鼠的血漿MDA濃度明顯降低(9.39±1.11 vs.16.61±0.67μM;P0.05),SOD活性明顯增加(68.65±6.37 vs.48.18±4.61 U/m L;P0.05);DHE染色顯示抑制TXNIP可以有效減少高血壓大鼠主動(dòng)脈血管組織中ROS生成(P0.01);Western blot進(jìn)一步顯示抑制TXNIP可以上調(diào)高血壓大鼠主動(dòng)脈血管組織中抗氧化蛋白(SOD2和NRF2)的表達(dá),抑制氧化酶(NOX4和NOX2)的表達(dá)。結(jié)論:高血壓大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能減退,抑制TXNIP可以顯著改善高血壓大鼠血管內(nèi)皮功能,抑制全身及血管組織的氧化應(yīng)激。第三部分TXNIP對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)控作用目的:高血壓病程中,血液循環(huán)中升高的Ang Ⅱ是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的主要病理刺激因素之一,Ang Ⅱ可以通過促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡等方式誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷。本部分主要探索外源性Ang Ⅱ刺激下,TXNIP對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)功能的調(diào)節(jié)作用。方法:構(gòu)建特異性TXNIP小干擾RNA(si RNA)和陰性對(duì)照(negative control,NC)RNA,體外轉(zhuǎn)染HUVEC,隨后使用Ang Ⅱ(10-6M)處理HUVEC。根據(jù)處理方式不同,分為以下5組:Control、Control+TXNIP-si RNA、Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+NC-si RNA和Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA。DCFH熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS生成;Annexin V/PI染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡;DAF-FM熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(nitric oxide,NO)的合成。Western blot檢測(cè)AKT、p-AKT(ser 473)、e NOS、p-e NOS(ser 1177)以及其他氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(NOX2、NOX4、SOD2、NRF2)和凋亡相關(guān)蛋白(ASK1、BCL2、BAX、cleaved-Caspase 3、Caspase 9)的表達(dá)變化。結(jié)果:(1)TXNIP-si RNA可以顯著抑制HUVEC中TXNIP在m RNA和蛋白水平的表達(dá)(均P0.01),NC-si RNA對(duì)TXNIP的表達(dá)無明顯影響(P0.05)。(2)與Control組相比,Ang Ⅱ處理后HUVEC細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多,細(xì)胞凋亡率明顯升高;同時(shí)e NOS的活性下調(diào),細(xì)胞內(nèi)NO的合成明顯減少(均P0.05)。(3)與Ang Ⅱ+NC-si RNA組相比,敲減TXNIP可以明顯減少Ang Ⅱ刺激下HUVEC中ROS的生成(P0.01),同時(shí)抑制NOX2和NOX4的蛋白表達(dá),上調(diào)SOD2和NRF2的蛋白表達(dá)(均P0.05)。(4)與Ang Ⅱ+NC-si RNA組相比,Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA組中HUVEC的細(xì)胞凋亡率明顯降低[(8.75±0.23)%vs.(14.23±1.60)%,P0.05],ASK1、cleaved-Caspase 3和Caspase 9的蛋白表達(dá)也顯著降低(均P0.05),而BCL2/BAX的比值升高(P0.05)。(5)Ang Ⅱ刺激狀態(tài)下,敲減TXNIP可以上調(diào)HUVEC中p-AKT(ser473)/AKT和p-e NOS(ser 1177)/e NOS的比值(均P0.05),并能部分恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)受損的NO合成(P0.05)。結(jié)論:TXNIP參與并介導(dǎo)了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,抑制TXNIP可以通過減輕氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能。第四部分TXNIP調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制研究目的:TXNIP是體內(nèi)主要的內(nèi)源性硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)系統(tǒng)抑制蛋白。然而高血壓狀態(tài)下,TXNIP是否通過影響TRX系統(tǒng)的激活進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙目前仍不明確。本部分主要探索TXNIP調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的內(nèi)在分子機(jī)制。方法:TXNIP-si RNA和NC-si RNA轉(zhuǎn)染HUVEC后外源性使用Ang Ⅱ處理細(xì)胞,分組方式與第三部分相同。RT-q PCR、Western blot、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞中TRX的表達(dá);提取HUVEC核蛋白檢測(cè)細(xì)胞核中TRX、AP-1、REF-1的表達(dá);使用硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase,TRXR)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中TRXR活性變化。隨后使用PX-12(一種TRX的抑制劑)預(yù)處理HUVEC,根據(jù)處理方式不同,分為以下4組:Control組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA組、Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA+PX-12組;檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS、細(xì)胞凋亡率以及e NOS和p-e NOS(ser 1177)的蛋白表達(dá)變化。以GV230為載體構(gòu)建TRX過表達(dá)質(zhì)粒(GV230-TRX)和陰性對(duì)照質(zhì)粒(GV230-NC),分別轉(zhuǎn)染HUVEC,分別在正�；駻ng Ⅱ刺激狀態(tài)下,檢測(cè)HUVEC中e NOS和p-e NOS(ser 1177)的蛋白表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)NO的合成變化。結(jié)果:(1)Ang Ⅱ可以代償性激活HUVEC的TRX系統(tǒng),與Control組相比,Ang Ⅱ組中TRX的m RNA和蛋白水平均有所升高(均P0.05),但TRXR活性無明顯變化(P0.05)。(2)與Ang Ⅱ+NC-si RNA組相比,Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA組中TRX的蛋白和m RNA表達(dá)水平進(jìn)一步增加,TRXR的活性顯著增強(qiáng)(均P0.05)。(3)Ang Ⅱ刺激狀態(tài)下,敲減TXNIP可以促進(jìn)HUVEC中TRX發(fā)生核轉(zhuǎn)位,上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子AP-1和REF-1的蛋白表達(dá)(均P0.05)。(4)TXNIP對(duì)HUVEC氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和e NOS功能激活的調(diào)節(jié)作用可以被PX-12完全逆轉(zhuǎn)。(5)Ang Ⅱ刺激狀態(tài)下,過表達(dá)TRX可以顯著上調(diào)HUVEC中p-e NOS(ser 1177)/e NOS的比值,并能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NO的合成(均P0.05)。結(jié)論:高血壓狀態(tài)下,TXNIP主要是通過負(fù)調(diào)控TRX系統(tǒng)的方式介導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙;維持TXNIP/TRX系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)可能有助于減輕高血壓對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R544.1
【部分圖文】：

⑤逐層縫合肌層、筋膜和皮膚后,再次消毒手術(shù)區(qū)域;將大鼠放于溫暖的毛毯上,待其完全清醒后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。(4)血壓、心率監(jiān)測(cè):使用動(dòng)物無創(chuàng)血壓計(jì)監(jiān)測(cè)大鼠清醒狀態(tài)下的血壓和心率。先將大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練,每次在相同的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行。血壓監(jiān)測(cè)前維持環(huán)境溫度24℃左右,周圍環(huán)境安靜。將大鼠安撫后放置于固定囊袋中,露出鼠尾,用溫?zé)岬拿聿潦檬蛊湮矂?dòng)脈充分?jǐn)U張;將加壓尾套放置于鼠尾根部,使其與尾動(dòng)脈緊密貼合;在大鼠充分安靜狀態(tài)下,打開血壓監(jiān)測(cè)系統(tǒng),待屏幕上的脈搏波信號(hào)出現(xiàn)并持續(xù)穩(wěn)定5min后開始測(cè)血壓和心率,連續(xù)測(cè)量5次,取平均值并記錄。

(5)建模評(píng)估:所有大鼠術(shù)前均進(jìn)行基礎(chǔ)血壓測(cè)定,術(shù)后每周定期進(jìn)行常規(guī)血壓和心率測(cè)定。建模4W后,若收縮壓大于160mmHg以上,且解剖后左腎無壞死、萎縮或纖維化則判斷為建模成功[26];反之建模失敗,重新建模。建模4W后,各組大鼠的實(shí)時(shí)血壓和心率監(jiān)測(cè)波形如圖1.2。1.3.2心臟、血管組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色

各組大鼠在術(shù)前的基線血壓和心率均無顯著差異(P>0.05),建模后每周檢測(cè)各組大鼠的血壓和心率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延長(zhǎng),高血壓組大鼠的收縮壓(systolic pressure,SBP)和平均動(dòng)脈血壓(mean blood pressure,MBP)均逐漸升高,而假手術(shù)組和對(duì)照組大鼠的SBP和MBP均無顯著變化,提示通過2K1C手術(shù)可以成功誘導(dǎo)大鼠發(fā)生高血壓。建模4W后,與假手術(shù)組大鼠相比,高血壓組大鼠的SBP顯著升高(181±6 vs.120±5 mmHg,P<0.01),MBP也顯著升高(156±8 vs.105±3 mmHg,P<0.01)。各組大鼠的心率無明顯差異(數(shù)據(jù)未展示,P>0.05)。2.2高血壓大鼠血漿Ang II升高
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