本文關(guān)鍵詞：Sonic hedgehog信號(hào)通路對(duì)正常角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte,KC)是表皮的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞,占表皮細(xì)胞的80%以上。KC增殖過度、凋亡不足可導(dǎo)致多種良、惡性皮膚疾病的發(fā)生。因此,關(guān)于KC增殖與凋亡的調(diào)控機(jī)制研究始終是皮膚學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)。越來越多的研究表明,一些高度保守的、調(diào)控胚胎發(fā)育的信號(hào)通路中部分基因突變或異常激活可導(dǎo)致KC的增殖或凋亡異常,其中,Sonic hedgehog(Shh)信號(hào)通路在近年來倍受關(guān)注。現(xiàn)有資料表明,Shh信號(hào)通路能夠調(diào)控正常的增殖和凋亡,抑制該通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠抑制KC的過度增殖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但其分子機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞的代謝活動(dòng)是在動(dòng)態(tài)連貫、復(fù)雜有序的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的整體調(diào)控下完成,因此,系統(tǒng)闡明Shh信號(hào)通路調(diào)控正常KC增殖與凋亡的分子機(jī)制,最首要的任務(wù)就是先要明確Shh信號(hào)通路究竟通過哪條或哪些信號(hào)通路影響KC的增殖和凋亡。大量研究表明,Shh信號(hào)通路與胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路(extracellular signal-regulated kinase kinase/extracellular signal-regulated kinase,MEK/ERK)信號(hào)通路之間存在密切聯(lián)系,MEK/ERK信號(hào)通路廣泛存在于真核生物細(xì)胞中,是機(jī)體細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移等信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的核心,是很多信號(hào)通路的下游通路。我們推測(cè)MEK/ERK信號(hào)通路在Shh信號(hào)通路調(diào)控KC的代謝過程中可能具有重要作用。此外,目前公認(rèn)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號(hào)通路是MEK/ERK信號(hào)通路的直接上游通路,大量研究提示Shh信號(hào)通路與EGFR信號(hào)通路在KC之間的關(guān)系也非常密切,如Shh信號(hào)通路能夠刺激KC產(chǎn)生EGF,同時(shí)EGF又可以調(diào)節(jié)Shh信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子Gli-1的表達(dá)等,進(jìn)一步提示MEK/ERK信號(hào)通路在Shh信號(hào)通路調(diào)控KC的生物學(xué)行為過程中可能扮演重要角色,目前尚未見類似報(bào)道。本課題旨在通過研究,闡釋以下問題:①系統(tǒng)闡明Shh信號(hào)通路對(duì)正常KC增殖及凋亡的影響;②探討Shh信號(hào)通路調(diào)控KC增殖及凋亡的分子機(jī)制,重點(diǎn)明確Shh信號(hào)通路與MEK/ERK信號(hào)通路的作用關(guān)系,同時(shí)觀察Shh信號(hào)通路對(duì)PI3K/AKT和JAK/STAT1/3信號(hào)通路的影響;③進(jìn)一步探討Shh與EGFR信號(hào)通路在正常KC增殖和凋亡調(diào)控中的作用關(guān)系以及二者對(duì)MEK/ERK信號(hào)通路的影響。方法:體外培養(yǎng)人正常原代KC、永生化KC系Ha Ca T,采用RT-PCR和western blot檢測(cè)KC中Shh信號(hào)通路關(guān)鍵分子Ptch-1、Gli-1的表達(dá);CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)PI標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞周期分布,流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡率;采用real time PCR和western blot分別檢測(cè)目的分子的m RNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平:依次觀察特異性調(diào)控Shh信號(hào)通路對(duì)p-ERK1/2、p-AKT、p-STAT1、p-STAT3表達(dá)的影響;特異性阻斷MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)Shh通路誘導(dǎo)的cyclin D1和Bcl2表達(dá)的影響;聯(lián)合調(diào)控Shh通路和EGFR信號(hào)通路對(duì)Shh誘導(dǎo)的p-ERK1/2、cyclin D1及Bcl2表達(dá)的影響。結(jié)果:1.Shh信號(hào)通路在正常KC中處于開放的活性狀態(tài);特異性上調(diào)Shh信號(hào)通路活性可促進(jìn)正常KC增殖、抑制凋亡,下調(diào)Shh信號(hào)通路活性則抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡;特異性激活和抑制Shh信號(hào)通路活性能夠分別促進(jìn)和抑制KC中cyclin D1和Bcl2的表達(dá)。2.在正常KC中,Shh信號(hào)通路能夠激活MEK/ERK信號(hào)通路,而對(duì)PI3K/AKT、JAK/STAT1及JAK/STAT3等通路活性無明顯影響;MEK/ERK的特異性抑制劑U0126能夠阻斷Shh信號(hào)通路對(duì)KC增殖和凋亡的調(diào)控,并阻斷Shh通路誘導(dǎo)的cyclin D1及Bcl2的表達(dá)。3.EFGR信號(hào)通路可通過影響Shh信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子Gli-1、Gli-2的穩(wěn)定性及其受體分子(同時(shí)也是靶分子)Ptch-1的表達(dá)來調(diào)節(jié)Shh通路活性;聯(lián)合調(diào)控Shh通路和EGFR信號(hào)通路可協(xié)同誘導(dǎo)ERK1/2的活化和cyclin D1與Bcl2的表達(dá)。結(jié)論:1.Shh信號(hào)通路通過誘導(dǎo)cyclin D1與Bcl2的表達(dá)調(diào)控正常KC增殖與凋亡。2.Shh信號(hào)通路能夠激活正常KC中的MEK/ERK信號(hào)通路,而對(duì)PI3K/AKT、JAK/STAT1及JAK/STAT3等通路活性無明顯影響。3.MEK/ERK通路的激活為Shh信號(hào)通路調(diào)控正常KC增殖與凋亡所必須,Shh信號(hào)通路依賴于MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控KC的增殖與凋亡及cyclin D1與Bcl2的表達(dá)。4.Shh信號(hào)通路與EGFR通路可協(xié)同誘導(dǎo)MEK/ERK通路的激活和cyclin D1與Bcl2的表達(dá),且EGFR信號(hào)通路對(duì)Shh通路活性具有調(diào)節(jié)作用。綜上所述,本研究首次提出并發(fā)現(xiàn)MEK/ERK信號(hào)通路是Sonic hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控人正常KC增殖與凋亡的重要分子機(jī)制,為系統(tǒng)闡明Sonic hedgehog信號(hào)通路調(diào)控KC增殖及凋亡的分子機(jī)制開辟了新視角,并為最終明確KC增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制以及KC異常性皮膚病的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：正常角質(zhì)形成細(xì)胞 Sonic hedgehog信號(hào)通路 MEK/ERK信號(hào)通路 增殖 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R751
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-15
• 文獻(xiàn)回顧15-33
• 第一部分 實(shí)驗(yàn)材料33-39
• 1 儀器33-34
• 2 主要試劑34-36
• 3 主要試劑配制36-38
• 4 細(xì)胞株38-39
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)方法39-52
• 1 觀察Shh信號(hào)通路在正常KC中的活性及特異性調(diào)控Shh通路對(duì)KC增殖及凋亡的影響39-46
• 1.1 檢測(cè)正常KC中Shh信號(hào)通路的活性狀態(tài)39-42
• 1.2 調(diào)控Shh信號(hào)通路活性對(duì)正常KC增殖及凋亡的影響42-43
• 1.3 調(diào)控Shh通路活性對(duì)正常KC中cyclin D1和Bcl2表達(dá)的影響43-46
• 2 探討Shh信號(hào)通路調(diào)控正常KC增殖與凋亡的分子機(jī)制46-49
• 2.1 調(diào)控Shh信號(hào)通路對(duì)MEK/ERK信號(hào)通路的影響46
• 2.2 調(diào)控Shh信號(hào)通路對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響46
• 2.3 調(diào)控Shh信號(hào)通路對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的影響46-47
• 2.4 U0126阻斷MEK/ERK通路對(duì)Shh通路調(diào)控KC增殖與凋亡的影響47-49
• 2.5 U0126對(duì)Shh信號(hào)通路誘導(dǎo)的cyclin D1和Bcl2表達(dá)的影響49
• 3 探討Shh通路與EGFR通路在正常KC增殖與凋亡調(diào)控中的作用關(guān)系49-52
• 3.1 聯(lián)合調(diào)控Shh與EGFR信號(hào)通路對(duì)KC增殖與凋亡的影響49-50
• 3.2 聯(lián)合調(diào)控Shh與EGFR信號(hào)通路對(duì)MEK/ERK通路活性的影響50
• 3.3 聯(lián)合調(diào)控Shh與EGFR信號(hào)通路對(duì)cyclin D1和Bcl2表達(dá)的影響50-51
• 3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析51-52
• 第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-67
• 1 Shh信號(hào)通路在正常KC中處于激活狀態(tài)并調(diào)控KC的增殖與凋亡52-55
• 1.1 Shh信號(hào)通路在正常KC中處于激活狀態(tài)52
• 1.2 特異性調(diào)控Shh通路活性能夠調(diào)控正常KC的增殖與凋亡52-54
• 1.3 特異性調(diào)控Shh通路活性能夠調(diào)控正常KC中cyclin D1和Bcl2的表達(dá)54-55
• 2 Shh信號(hào)通路調(diào)控正常KC增殖與凋亡的分子機(jī)制55-62
• 2.1 Shh通路特異性激活MEK/ERK通路，但對(duì)PI3K/AKT和JAK/STAT1/3通路活性無明顯影響55-57
• 2.2 阻斷ERK通路活性能夠阻斷Shh信號(hào)通路對(duì)KC增殖與凋亡的調(diào)控57-61
• 2.3 阻斷ERK通路活性能夠阻斷Shh信號(hào)通路誘導(dǎo)的cyclin D1和Bcl2的表達(dá)61-62
• 3 Shh信號(hào)通路與EGFR通路在正常KC增殖與凋亡調(diào)控中的作用關(guān)系62-67
• 3.1 聯(lián)合調(diào)控Shh與EGFR信號(hào)通路對(duì)KC增殖與凋亡的影響62-64
• 3.2 EGFR信號(hào)通路能夠調(diào)控Shh信號(hào)通路的活性64-65
• 3.3 Shh通路與EGFR通路能夠協(xié)同誘導(dǎo)ERK通路激活及cyclin D1和Bcl2的表達(dá)65-67
• 第四部分 討論67-71
• 小結(jié)71-72
• 參考文獻(xiàn)72-85
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果85-87
• 致謝87

  本文關(guān)鍵詞：Sonic hedgehog信號(hào)通路對(duì)正常角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：286429