研究背景和目的:乳腺癌(Breast cancer,BC)是世界上導致女性癌癥相關死亡率的第二大原因,并且超過90%的病例是死于轉移。為了形成轉移病變,惡性腫瘤細胞必須從原位腫瘤脫離,侵入周圍的間質組織,進入循環(huán)系統(tǒng)并存活,最終成為循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)。這一過程又稱之為集體侵襲(collective invasion),是臨床靶向治療的重要窗口期,因為它可以在明顯臨床癥狀出現前就發(fā)生。BC組織是高度異質性的,包含多種細胞成分�；谵D錄組(trascriptome)的分析表明即使是腫瘤細胞也有不同免疫表型,BC因此可以主要分為3個亞型:管腔型(激素受體陽性)、HER2過表達型(HER2陽性,激素受體陰性)和三陰型乳腺癌(HER2和激素受體陰性)。值得注意的是,BC的進展伴隨著細胞活動能力(motility)和間質侵犯力的增強。在臨床病例和動物模型中發(fā)現,與其他腫瘤細胞相比,處于侵襲性邊緣或集體侵襲過程的癌癥細胞具有不同的免疫表型。大量的研究證實細胞角蛋白14(cytokeratin 14,CK14),一種正常乳腺發(fā)育所必須的蛋白質,可以賦予腫瘤細胞一種保守的向基底細胞轉變的能力。乳腺胚胎斑中的遷徙細胞表現為CK14~+CK8~+SMA~-。正常乳腺成體干細胞和具有顯著侵襲性的癌癥細胞,而不是相對比較惰性的癌癥細胞,可以高表達CK14。盡管正常導管細胞不表達CK14,導管型腫瘤細胞重新表達CK14有助于轉移的發(fā)生。但其中的分子調控機制仍不清楚。正常發(fā)育過程中,Wnt/β-catenin信號通路在調控包括干細胞多能性和分化能力等細胞生物學行為過程中具有重要作用。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活可以導致乳腺異型增生,其中包含CK14~+CK5~+CK8~-αSMA~-基底樣細胞,表明CK14的表達可能受到Wnt/β-catenin信號通路的調控。然而,另外一個值得關注的問題是這一過程中,Wnt配體的具體細胞學來源不明。免疫細胞被認為是一種微環(huán)境調控成員,在BC發(fā)生和進展過程中發(fā)揮重要作用。在疾病早期,組織能夠分泌細胞因子/炎癥因子,比如TGF-β、IFN-γ和TNF-α,來抑制腫瘤的生長。而當慢性損傷和致癌物持續(xù)存在,這種微妙的平衡將被非可控性炎癥打破,轉變成腫瘤發(fā)生過程中的起始事件。BC細胞可以通過mTOR信號通路或者分泌粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)來募集髓系來源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)進入腫瘤內。MDSCs起源于骨髓和脾臟,可以分為2種主要類型:粒細胞型MDSCs(granulocytic MDSCs,PMN-MDSCs,CD45~+CD11b~+Ly6G~(hi))和單核細胞型MDSCs(monocytic M-MDSCs,CD45~+CD11b~+Ly6C~(hi))。課題組最近一篇文章表明組氨酸脫羧酶(histamine decarboxylase,Hdc)可以作為骨髓髓系偏向造血干細胞/前體細胞(myeloid-biased hematopoietic stem cell/progenitor cell,MB-HSC/HSPC)的標記物。在衰老、損傷和腫瘤發(fā)生時,MB-HSC/HSPC可以作為未成熟髓系細胞的組織學來源。表達Hdc的PMN-MDSCs在動物模型中可以通過募集Foxp3~+調節(jié)性T細胞來促進結腸癌的發(fā)生。在過去的十年內,探索基于抑制癌癥相關MDSCs的個性化靶向治療策略取得了顯著進展。然而,在這些方法可以應用于臨床之前,許多備受關注的爭論尚需得到解決。例如,迄今為止我們對于促進BC進展的免疫細胞的具體身份尚不清楚,其中一個重要原因也是因為這些細胞的異質性。本研究中,我們通過臨床病例和動物模型觀察了CK14表達在晚期BC進展過程中的作用和調節(jié)機制。結果表明:相比于原位腫瘤,在BC轉移灶中Hdc~+PMN-MDSCs數量顯著增多并且表達高水平的Wnts來異常激活臨近癌癥細胞內的Wnt/β-catenin信號通路,從而提高CK14的表達。這些研究結果進一步揭示了Hdc~+PMN-MDSCs和浸潤性腫瘤細胞之間的相互作用機制,并且表明通過抑制或阻斷腫瘤相關Hdc~+PMN-MDSCs的靶向策略有助于乳腺癌治療。方法:1、搜集南昌大學第二附屬醫(yī)院和第四附屬醫(yī)院的乳腺癌手術標本蠟塊,制作成組織芯片,再通過常規(guī)染色和免疫組織化學染色評估和比較原發(fā)部位和轉移部位腫瘤細胞表達CK14的情況;2、構建Hdc-CreER~(T2);eGFP;MMTV-PyVT雌性小鼠乳腺癌轉移模型,通過免疫組化和流式細胞術分析轉移組織內MDSCs的構成和數量變化;3、通過免疫組化法觀察轉移BC細胞內β-catenin的表達和定位情況,來初步推斷Wnt/β-catenin信號通路異常激活情況;4、通過porcupine~(flox/flox)和iDTR轉基因小鼠,阻斷Hdc~+PMN-MDSCs來源的Wnts合成和分泌或去除所有Hdc~+免疫細胞,觀察體內BC形成和進展、BC細胞表達CK14和Wnt/β-catenin活化情況。結果:1、112例未發(fā)生轉移的管腔型乳腺癌中只有5例(4.5%)表達局灶CK14,而117例轉移性乳腺癌病例中有33例(28.2%)出現CK14的彌漫強陽性。2、在BC轉移病例內CD15~+PMN-MDSCs的數量顯著增多,流式細胞術結果進一步表明在轉移性BC動物模型內,Hdc~+PMN-MDSCs向腫瘤組織聚集并擴增。3、RNA-Seq和RT-PCR結果表明CK14~+BC組織內的Hdc~+PMN-MDSCs高表達多種Wnts,包括Wnt2,4,5a和7b。4、通過轉基因動物消除Hdc~+免疫細胞或其來源的Wnts可以顯著抑制BC轉移的發(fā)生以及CK14的陽性率。結論:綜上所述,我們的研究發(fā)現MDSCs,特別是Hdc~+PMN-MDSCs在轉移性BC組織內聚集和擴增,通過分泌高水平的Wnts,以類似旁分泌的形式異常激活臨近癌細胞內的Wnt/β-catenin信號通路,促進CK14的表達和BC的進展,為后期基于Hdc~+PMN-MDSCs靶向治療開發(fā)提供分子理論依據。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

基于前期發(fā)現Hdc+PMN-MDSCs在CK14+腫瘤組織內增多,且兩者之間具有密切的空間關系,所以課題組提出一個新的假說,認為Hdc+PMN-MDSCs可能是轉移性乳腺癌組織中的一個重要的Wnts細胞來源。因此,課題組使用porcupineflox/flox和iDTR小鼠來去除Hdc+PMN-MDSCs或其來源的Wnts,進一步證實這個假說的可能性。一共構建三種轉基因乳腺癌動物模型:1.Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox用于阻礙Hdc+免疫細胞分泌Wnts;2.Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT,DTR用于使用白喉毒素(DT)直接去除所有Hdc+免疫細胞;3.Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox;DTR轉基因小鼠用于同時消除Hdc+免疫細胞及其分泌的Wnts(圖1A)。研究結果表明:與對照組(Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT)相比,Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox小鼠轉移性腫瘤的數量顯著下降,但腫瘤組織內Hdc+PMN-MDSCs的數量和比例并未見顯著下降(圖1B)。Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,DTR與Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox小鼠相比,Hdc+PMN-MDSCs的數量和比例顯著下降,但轉移性腫瘤的數量并無明顯差別,表明在轉移過程中起關鍵作用的可能是Hdc+PMN-MDSCs來源的Wnts。為了進一步支持這個結論,對比分析Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox;DTR轉基因小鼠和其他兩組之間的轉移情況,發(fā)現轉移數量并無明顯差距(p>0.05)((圖1B))。綜上所述,這一部分結果支持在轉移性乳腺癌發(fā)展過程中,Hdc+PMN-MDSCs是微環(huán)境中高水平Wnts的主要來源之一(圖3)。4.2 Hdc~+PMN-MDSCs來源的Wnts有助于CK14 的表達

此前課題組已經發(fā)現Hdc+PMN-MDSCs與腫瘤組織CK14的不一致性表達有密切關系,且CK14+的病例預后較差。因此后續(xù)的研究繼續(xù)探討了Hdc+PMN-MDSCs來源的Wnts在推動乳腺癌轉移過程中的作用。但異常激活的Wnts/β-catenin是否與CK14的表達有關系,尚無證據支持。因此,接下來課題組進一步對比分析了去除Hdc+細胞或其來源的Wnts對腫瘤細胞表達CK14的影響。結果表明與Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT雌性乳腺癌小鼠相比,porcupineflox/flox、DTR和porcupineflox/flox/DTR三種動物模型內表達CK14的比例顯著降低,但三組之間沒有顯著差別,表明Hdc+PMN-MDSCs來源的Wnts是促進腫瘤細胞表達CK14的主要原因(圖2)。圖3.轉移性乳腺癌細胞和Hdc+PMN-MDSCs之間相互作用示意圖。乳腺癌細胞從原發(fā)腫瘤脫落,進入并在循環(huán)系統(tǒng)存活,最后在遠隔器官微環(huán)境中增殖。作為腫瘤微環(huán)境中的一個重要組成成分,Hdc+PMN-MDSCs被募集至轉移灶內并擴增。Hdc+PMN-MDSCs來源的Wnts以旁分泌樣的方式異常激活癌癥細胞的Wnt/β-catenin信號通路。β-catenin在胞漿和胞核的聚集可以上調CK14的表達,后者賦予轉移細胞基底樣表型,其特征為具有增強的增殖和抗凋亡能力。因此,浸潤的Hdc+PMN-MDSCs對于轉移灶的建立具有重要作用。未來需要進一步闡述轉移細胞和骨髓內Hdc+髓系偏向造血干細胞和前體細胞之間的相互作用。

圖2.Hdc+PMN-MDSCs來源的Wnts促進乳腺癌細胞表達CK14.與Wnts的水平一致,CK14陽性率在porcupineflox/flox、DTR和porcupineflox/flox/DTR轉基因動物模型中顯著降低(p<0.001)。5 結論
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本文編號：2863989