糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一。大量研究表明,氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子釋放以及細胞的凋亡在糖尿病神經(jīng)病變中起重要作用。目前,對于糖尿病神經(jīng)病變尚無有效的防治措施!近年眾多研究表明,低濃度氫分子(4%)及富氫液具有選擇性抗氧化、抗炎、抗凋亡作用,并已證明可應(yīng)用于多種疾病動物模型的治療,如:臟器的缺血/再灌注損傷、神經(jīng)退行病變、膿毒血癥等。因此,越來越多的學者認為氫氣與富氫液是一種新型的醫(yī)學氣體分子。本課題利用離體高糖培養(yǎng)的雪旺細胞(RSC 96)和在體糖尿病大鼠模型,探討富氫液對糖尿病神經(jīng)病變保護作用的可能機制,為臨床治療奠定基礎(chǔ)。實驗一、富氫液對高糖誘導雪旺細胞損傷的影響目的:高血糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及導致的雪旺細胞的凋亡在糖尿病神經(jīng)病變的病理生理過程中具有重要意義。富氫液具有選擇性抗氧化、抗炎、抗凋亡作用。本實驗擬利用高糖培養(yǎng)下的雪旺細胞(RSC96),探討富氫液對于高糖培養(yǎng)的雪旺細胞影響。方法:大鼠永生化雪旺細胞株(RSC96細胞)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,接種于6孔或96孔細胞培養(yǎng)板,3 m L/孔或200μL/孔,細胞密度2×l06/m L。第一部分:不同濃度高糖誘導下對雪旺細胞的影響,體外培養(yǎng)的雪旺細胞分為5組(n=30):正常對照組(5.6mmol/L)和高糖組(25 mmol/L、50mmol/L、100mmol/L)、甘露醇組,分別于培養(yǎng)24h、48h、72h應(yīng)用MTT(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法)法檢測高糖對RSC96細胞增殖的影響;同時應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測炎癥細胞因子(IL-1β,HMGBl)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物(MDA、8-羥基脫氧鳥苷)變化情況。第二部分:富氫培養(yǎng)液對高糖培養(yǎng)的雪旺細胞影響。1.體外培養(yǎng)的RSC96雪旺細胞接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)48 h,采用隨機數(shù)字表法將細胞分為6組(n=6):正常對照(Con)組、高糖(HG)組(根據(jù)第一部分實驗結(jié)果,50mmol/L高糖組入選)、富氫水(HS)組、HG+HS(0.15/0.30/0.60mmol/L)組,細胞培養(yǎng)采用正常培養(yǎng)液與不同濃度的含氫培養(yǎng)液培養(yǎng),給予或不給予高糖處理,48 h后收集細胞培養(yǎng)液,應(yīng)用MTT法檢測各組細胞增殖情況。2.探討飽和富氫培養(yǎng)液對于高糖所致雪旺細胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及凋亡的作用。實驗分為三組(n=6):正常對照(Con)組、高糖(HG)組、HG+HS(根據(jù)第二部分實驗,0.60mmol/L組入選)。對照組培養(yǎng)基含糖5.6mmol/L,HG組含糖50 mmol/L,HG+HS組為含有0.6mmol/L氫分子的高糖培養(yǎng)基。48h末,進行超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量;Elisa法測定炎癥因子IL-6、HMGBl的水平;流式細胞儀檢測細胞凋亡情況;Western blot法檢測細胞活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)表達水平。觀察含氫培養(yǎng)液對高糖誘導的雪旺細胞的損傷(氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及細胞凋亡)的影響。結(jié)果:第一部分:1.與Con組細胞相比,在24h、48h、72h末高糖處理組的氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、8-OHDG,細胞促炎癥因子的釋放均明顯增加,但在48h更為明顯;甘露醇組細胞無明顯變化;2.MTT法檢測結(jié)果表明,與對照組細胞相比在24h、48h、72h末,高糖處理組成活細胞數(shù)量少、死亡率高,且在48h末最為明顯(P0.05)。3.與對照組相比較,在高糖處理組中50mmol/L組,氧化應(yīng)激產(chǎn)物生成、炎癥因子釋放、細胞死亡率升高更為明顯(P0.05)。4.Con組與甘露醇組相比,上述指標無明顯差異(P0.05)。氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子的釋放參與高糖誘導雪旺細胞增殖,影響細胞的活力;各高糖處理組在48h時對體外培養(yǎng)雪旺細胞損傷最為嚴重,其中50mmol/L高糖培養(yǎng)基損傷最為嚴重。第二部分:MTT法結(jié)果表明:給予不同濃度的含氫培養(yǎng)液處理對于正常培養(yǎng)液雪旺細胞的增殖活力無明顯影響(P0.05);給予不同濃度的含氫培養(yǎng)液處理均可以顯著降低含高糖培養(yǎng)基對于雪旺細胞的損傷,且0.60mmol/L的含氫培養(yǎng)液作用效果明顯,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與Con組相比,HG和HG+HS組SOD活性下降,炎癥因子釋放(IL-6與HMGBl),MDA含量、細胞內(nèi)活化的caspase-3蛋白以及凋亡的雪旺細胞數(shù)目表達均明顯升高(P0.05);與高糖組比較,HG+HS組細胞活力升高,SOD活性升高,MDA含量減少,IL-6、HMGB-l水平、細胞凋亡數(shù)目以及細胞內(nèi)活化的Caspase-3蛋白表達均明顯降低(P0.05)。結(jié)論:給予不同濃度的含氫培養(yǎng)液處理均可以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的損傷;降低促炎癥因子的釋放;下調(diào)Caspase-3活化片段蛋白的表達,減少高糖誘導下雪旺細胞的凋亡,其中0.60mmol/L的含氫培養(yǎng)液處理效果最為明顯。實驗二、飽和富氫液對糖尿病外周神經(jīng)病變大鼠的保護作用目的:飽和富氫液是一種溶解氫氣至飽和狀態(tài)的生理鹽水,通過體外高糖培養(yǎng)雪旺細胞離體模型的研究發(fā)現(xiàn),富氫液具有抗氧化、抗炎、減少高糖誘導雪旺細胞凋亡的作用。本實驗以前期體外培養(yǎng)雪旺細胞實驗研究為基礎(chǔ),利用糖尿病大鼠實驗模型,擬探討飽和富氫液對糖尿外周神經(jīng)病變治療效果。方法:健康雄性SD大鼠,體重280-310g(中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)。腹腔注射鏈脲霉素(65 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。第一部分:不同劑量的飽和富氫液對于糖尿周圍神經(jīng)病變大鼠模型的保護作用。40只大鼠隨機分為5組(n=6),正常對照組(Con組),糖尿病模型組(DM組)、飽和富氫液處理組(DM+HS 5 ml,10ml,20ml/kg組)。建立糖尿病模型成功4周后,DM+HS組大鼠腹腔注射不同劑量飽和富氫液(5 ml,10ml,20ml/kg/day)連續(xù)治療4周,Con組與DM組大鼠腹腔給予生理鹽水注射持續(xù)4周,觀察各組大鼠神經(jīng)疼痛行為學在不同時間點(5thW、6thW、7thW、8thW末)變化。檢測各組大鼠基礎(chǔ)情況下及第4、8周末,坐骨神經(jīng)傳導速度(MNCV)的變化;第8周末,檢測血糖水平及糖基化終末產(chǎn)物含量,坐骨神經(jīng)炎癥因子(HMGB1、TNF-α、IL-1β及IL-10)水平、氧化應(yīng)激產(chǎn)物的含量(MDA、SOD)。第二部分:飽和富氫液對于糖尿周圍神經(jīng)病變大鼠模型坐骨神經(jīng)細胞凋亡的影響。18只大鼠隨機分為3組(n=6),正常對照組(Con)組、糖尿病模型組(DM)、飽和富氫液處理組(DM+HS 10ml)。HS(10ml/kg/day)組給予飽和富氫液連續(xù)治療4周,Con組、DM組給予同等體積的生理鹽水,8周末,Western blot法檢測坐骨神經(jīng)細胞中活化的Caspase-3、Bax以及Bcl-2蛋白表達水平。結(jié)果:第一部分第8周末,與基礎(chǔ)值相比,Con組大鼠體質(zhì)量增加,糖基化終末產(chǎn)物、血糖水平、神經(jīng)痛閾、MNCV坐骨神經(jīng)炎癥因子水平與基礎(chǔ)值比較無明顯變化。與Con組大鼠相比,糖尿病大鼠體質(zhì)量降低、糖基化終末產(chǎn)物、血糖水平明顯升高、痛閾值明顯降低、炎癥因子釋放與氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量增加(P﹤0.05);與DM組相比,飽和富氫液治療的各組大鼠體質(zhì)量和血糖水平無明顯改善(P0.05),但大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度增加、熱痛閾和機械性痛閾提高(P﹤0.05),坐骨神經(jīng)中氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量以及TNF-α、HMGB1、IL-1β水平降低,IL-10水平升高,且10ml/kg飽和富氫液治療組效果最為明顯(P﹤0.05)。第二部分:與Con組相比,DM組與HG+HS組大鼠坐骨神經(jīng)中活化的Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達增加,與DM組相比較,HG+HS組大鼠坐骨神經(jīng)中活化的Caspase-3、Bax蛋白表達減少,Bcl-2蛋白表達增加(P﹤0.05)。結(jié)論:氧化應(yīng)激、炎癥因子釋放以及細胞凋亡參與了糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展;飽和富氫液可通過抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)炎癥因子釋放,對糖尿病周圍神經(jīng)病變產(chǎn)生保護作用。實驗三、線粒體ATP敏感性鉀通道參與富氫液對糖尿病外周神經(jīng)病變大鼠的保護作用目的:飽和富氫液可通過抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)炎癥因子釋放,有效的減輕糖尿周圍神經(jīng)病變損傷。線粒體ATP敏感性鉀通道(Mito KATP通道)是多種處理措施或藥物的作用靶點,該通道激活后可有效的減輕神經(jīng)細胞的損傷。本實驗擬探討飽和富氫液對糖尿周圍神經(jīng)病變保護機制,是否與線粒體ATP敏感性鉀通道激活相關(guān)。方法:腹腔注射鏈脲霉素(65 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型,18只糖尿病大鼠,隨機分為3組:分為糖尿病組(DM組)、富氫水治療組(HS組)、ATP敏感鉀通道阻滯劑組(5-HD組)。HS組、5-HD組大鼠造模成功4周后,給予腹腔注射飽和富氫液(10ml/kg/day)連續(xù)治療4周,DM組給予腹腔注射生理鹽水(10ml/kg/day)。第8周末,檢測各組大鼠坐骨疼痛行為學變化、神經(jīng)傳導速度功能的變化;并檢測坐骨神經(jīng)炎性因子(HMGB1、TNF-α、IL-1β、及IL-10)、氧化應(yīng)激水平及坐骨神經(jīng)細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果:(1)第8周末,各組糖尿病大鼠體質(zhì)量降低、血糖水平升高;與DM組、5-HD組相比,飽和富氫液治療組血清糖基化終末產(chǎn)物明顯降低,糖尿病組與5-HD組相比無明顯變化(P﹤0.05);(2)第8周末,與飽和富氫液治療組相比,糖尿病組、5-HD組大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度減慢、熱痛閾和機械性痛閾降低(P﹤0.05);糖尿病組與5-HD組相比無明顯變化(P0.05)。(3)第8周末,與飽和富氫液治療組相比,糖尿病組、5-HD組大鼠坐骨神經(jīng)HMGB1、TNF-α、IL-1β表達水平升高,IL-10表達水平降低(P﹤0.05)。(4)第8周末,與飽和富氫液治療組相比,糖尿病組、5-HD組大鼠坐骨神經(jīng)凋亡陽性細胞數(shù)目增加,Caspase-3蛋白表達增加(P﹤0.05)。結(jié)論:飽和富氫液產(chǎn)生抗氧化、抗凋亡作用、調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放,發(fā)揮對糖尿病周圍神經(jīng)病變產(chǎn)生保護作用,可能與ATP敏感性鉀通道的激活相關(guān)。小結(jié)1.飽和富氫液可有效地減少高糖誘導的雪旺細胞損傷,該保護作用與飽和富氫液調(diào)控炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激、抗凋亡相關(guān);2.飽和富氫液減輕大鼠糖尿病神經(jīng)病變的機制,與調(diào)控炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān);3.飽和富氫液可通過抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用,部分逆轉(zhuǎn)糖尿病引發(fā)外周神經(jīng)病變,該機制與線粒體ATP敏感性鉀通道的激活相關(guān);治療過程中均未發(fā)現(xiàn)毒副作用,為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R587.2;R747.9
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學博士學位論文 飽和富氫液對糖尿病大鼠外周神經(jīng)病變的保護作用干，近端刺激電極置于坐骨切跡，遠端刺激電極置于踝內(nèi)側(cè)，記錄電極置于同側(cè)足恥第一股間肌處，參考電極置于刺激電極和記錄電極之間。用強度為 3V 的單脈沖方波刺激，記錄近、遠端坐骨神經(jīng)產(chǎn)生動作電位的潛伏期，同時測定兩刺激電極與記錄電極之間的距離，見圖 1。代入公式：MNCV (m/s)=兩刺激電極與記錄電極之間距離差/兩刺激電極產(chǎn)生的動作電位潛伏期之差，計算出 MNCV。

天津醫(yī)科大學博士學位論文 飽和富氫液對糖尿病大鼠外周神經(jīng)病變的保護作用干，近端刺激電極置于坐骨切跡，遠端刺激電極置于踝內(nèi)側(cè)，記錄電極置于同側(cè)足恥第一股間肌處，參考電極置于刺激電極和記錄電極之間。用強度為 3V 的單脈沖方波刺激，記錄近、遠端坐骨神經(jīng)產(chǎn)生動作電位的潛伏期，同時測定兩刺激電極與記錄電極之間的距離，見圖 1。代入公式：MNCV (m/s)=兩刺激電極與記錄電極之間距離差/兩刺激電極產(chǎn)生的動作電位潛伏期之差，計算出 MNCV。
【共引文獻】

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本文編號：2864094