背景:非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(Non-traumatic osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一種骨科常見的致殘性疾病,其發(fā)病率較高,且好發(fā)于20-50歲的青壯年。激素的使用是ONFH的常見且明確的致病因素,然而,激素導(dǎo)致該疾病的機(jī)制目前尚不清楚。近年來,干細(xì)胞移植已被用于ONFH的治療,且已經(jīng)取得了一定的效果,但是,移植進(jìn)去的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化和遷移能力降低,從而導(dǎo)致該治療的失敗率居高不下。另外,我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)去除其致病因素后,該疾病仍然持續(xù)進(jìn)展。因此,我們推測(cè)股骨頭壞死骨組織似乎在釋放某種信號(hào)影響骨組織內(nèi)正常的MSCs以及移植的健康MSCs的修復(fù)作用。外泌體是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間信號(hào)傳遞方式,是一種細(xì)胞外囊泡,具有雙層膜結(jié)構(gòu)。由于外泌體的雙層膜具有保護(hù)作用,使得外泌體內(nèi)的信號(hào)分子更穩(wěn)定,傳遞范圍更廣,影響更強(qiáng)。因此,我們推測(cè),ONFH骨微環(huán)境中的外泌體可能損害了MSCs的修復(fù)作用。然而,關(guān)于股骨頭壞死組織內(nèi)外泌體損傷MSCs的修復(fù)作用尚未見相關(guān)報(bào)道。因此,我們分別從細(xì)胞、人體組織、動(dòng)物模型三個(gè)層面分別探索了ONFH外泌體的作用,并對(duì)其致病機(jī)制做了簡單的嘗試。目的:本研究通過提取ONFH骨組織外泌體,分別探討其對(duì)MSCs的成骨分化、遷移的影響并證明ONFH骨組織來源外泌體(ONFH-derived exosomes,ONFH-exos)的致病作用;探討ONFH骨組織外泌體蛋白譜的變化并找到其致病的關(guān)鍵分子;尋找ONFH骨組織外泌體的致病機(jī)制;驗(yàn)證正常骨組織外泌體對(duì)地塞米松處理的MSCs的成骨分化和遷移修復(fù)作用,以及對(duì)ONFH的治療作用。方法:用超速離心法從骨組織提取外泌體,并使用透射電鏡、納米粒子示蹤分析以及外泌體標(biāo)志蛋白檢測(cè)對(duì)其鑒定。用ONFH-exos處理S-D大鼠,然后通過mcro-CT以及組織學(xué)切片檢測(cè)該外泌體的體內(nèi)作用。用ONFH-exos處理人原代間充質(zhì)干細(xì)胞(primary human mesenchymal stem cells,HMSCs)以及C3H10T1/2細(xì)胞,用Western blotting和茜素紅染色試驗(yàn)檢測(cè)兩種細(xì)胞的成骨分化作用;用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移作用;用CCK-8以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的增殖作用;用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。然后,用Itraq聯(lián)合TOF-LC-MS/MS分析ONFH-exos蛋白質(zhì)譜,鑒定差異蛋白;通過生物信息學(xué)分析,找到其中與成骨和分化相關(guān)的關(guān)鍵分子;用Western blotting和劃痕實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證該分子的作用以及尋找其相關(guān)通路。最后,用micro-CT和組織學(xué)檢查驗(yàn)證正常外泌體對(duì)S-D大鼠股骨頭壞死樣改變的預(yù)防作用。結(jié)果:通過尾靜脈注射ONFH-exos,能夠?qū)е耂-D大鼠發(fā)生股骨頭壞死樣改變。ONFH-exos能夠被HMSCs和C3H10T1/2細(xì)胞攝取,并能抑制成骨分化指標(biāo)如:堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),骨鈣素(bone gla protein,BGLAP),Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ,COLⅠ),骨橋蛋白(osteopontin,OPN)的表達(dá),并能抑制鈣鹽沉積。通過劃痕實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ONFH-exos可以抑制HMSCs和C3H10T1/2細(xì)胞的遷移。通過蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了64種改變明顯的差異蛋白,并最終根據(jù)生物信息學(xué)和文獻(xiàn)報(bào)道,發(fā)現(xiàn)了整合素α2b(Integrinα2b,CD41)可作為關(guān)鍵分子。并證明了由于缺乏CD41,ONFH-exos可以引起HMSCs和C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化和遷移能力的降低導(dǎo),在此過程中,CD41/整合素β3-FAK-PI3K/Akt-Runx2通路起到了重要作用。而富含CD41的正常骨組織外泌體可促進(jìn)HMSCs和C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化和遷移,尾靜脈注射富含CD41的正常骨組織外泌體可以防止S-D大鼠股骨頭壞死樣改變的發(fā)生。結(jié)論:股骨頭壞死骨組織可以通過釋放外泌體抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的分化和遷移,從而導(dǎo)致了干細(xì)胞移植的高失敗率以及疾病的不可逆性。其主要原因可能是由于股骨頭壞死外泌體中CD41含量的減低,同時(shí),CD41/integrinβ3-FAK-PI3K/Akt-Runx2通路在此過程中,起到了重要的作用。富含CD41的正常外泌體可以通過促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化和移植,有效防止了股骨頭壞死的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R681.8
【部分圖文】：

綜上所述,傳統(tǒng)的治療對(duì)ONFH無效,MSC移植的失敗率高,而原因尚不清楚。我們的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,壞死區(qū)骨組織來源的外泌體由于缺乏CD41,從而損害了MSCs的成骨分化和遷移而促進(jìn)了ONFH的進(jìn)展,且導(dǎo)致MSCs相關(guān)治療無效。ONFH的CD41豐富的外泌體可以通過補(bǔ)充CD41激活CD41/整合素β3-FAK-Akt-Runx2通路防止GC誘導(dǎo)的大鼠ONFH樣變化的發(fā)生。我們的研究證實(shí)了壞死區(qū)向間充質(zhì)干細(xì)胞傳遞信號(hào),損傷了間充質(zhì)干細(xì)胞的修復(fù)能力。我們的發(fā)現(xiàn)是對(duì)ONFH發(fā)病機(jī)制的擴(kuò)展,同時(shí),探討發(fā)掘出了富含CD41外泌體的潛在治療價(jià)值。而CD41是否可以作為診斷標(biāo)志物還有待進(jìn)一步研究。此外,本研究也存在一些不足:首先,部分組織由于在液氮中儲(chǔ)存時(shí)間較長(<1年),因此,這可能會(huì)導(dǎo)致部分組織中的外泌體的內(nèi)容物或者功能發(fā)生改變。其次,本研究中,組織外泌體不是單一細(xì)胞來源的,而是多細(xì)胞來源的,因此,可能會(huì)給我們找到關(guān)鍵分子以及關(guān)鍵的細(xì)胞亞型帶來困難。然后,盡管超速離心法是外泌體提取的金標(biāo)準(zhǔn)也是最常用的提取方法[53],但是這種方法會(huì)造成部分外泌體的破裂[54]。最后,本研究所納入的病人樣本量較小,因此,需要在更多的病人標(biāo)本中加以驗(yàn)證。而且,本探討對(duì)機(jī)制部分的探討較淺,需要對(duì)此機(jī)制進(jìn)行更深入的探討。圖2 ONFH和正常外泌體的表征和攝取實(shí)驗(yàn)

ONFH和正常外泌體的表征和攝取實(shí)驗(yàn)

ONFH-exos在S-D大鼠體內(nèi)的效果
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